Протеиназа К mNGS (жидкая)
Протеиназа К представляет собой стабильную сериновую протеазу с широкой субстратной специфичностью.Он разрушает многие белки в нативном состоянии даже в присутствии детергентов.Данные исследований кристаллической и молекулярной структуры показывают, что фермент принадлежит к семейству субтилизинов с каталитической триадой активного центра (Asp39-Его69-Сир224).Преимущественным местом расщепления является пептидная связь, примыкающая к карбоксильной группе алифатических и ароматических аминокислот с заблокированными альфа-аминогруппами.Он широко используется из-за своей широкой специфичности.Эта протеиназа К специально разработана для mNGS.По сравнению с другой протеиназой К, она содержит еще меньше примесей нуклеиновых кислот при тех же ферментативных характеристиках, что может лучше гарантировать дальнейшее применение mNGS.
Условия хранения
2-8℃ в течение 2 лет
Спецификация
| Появление | Бесцветная или светло-коричневая жидкость |
| Активность | ≥800 Ед/мл |
| Концентрация белка | ≥20 мг/мл |
| Никасе | Ничего не обнаружено |
| ДНКаза | Ничего не обнаружено |
| РНКаза | Ничего не обнаружено |
Характеристики
| Номер ЕС | 3.4.21.64(Рекомбинант из альбома Tritirachium) |
| Изоэлектрическая точка | 7,81 |
| Оптимальный pH | 7,0- 12,0 Рис. 1 |
| Оптимальная температура | 65 ℃ Рис. 2 |
| стабильность pH | pH 4,5-12,5 (25 ℃, 16 ч) Рис. 3 |
| Термическая стабильность | Ниже 50 ℃ (pH 8,0, 30 мин) Рис. 4 |
| Стабильность хранения | Активность более 90% в течение 12 месяцев при 25 ℃ |
| Активаторы | ДСН, мочевина |
| Ингибиторы | Диизопропилфторфосфат;фенилметилсульфонилфторид |
Приложения
1. Генетический диагностический набор.
2. Наборы для экстракции РНК и ДНК.
3. Экстракция небелковых компонентов из тканей, деградация белковых примесей, например ДНК.вакцины и препарат гепарина
4. Подготовка хромосомной ДНК импульсным электрофорезом.
5. Вестерн-блоттинг
6. Реагенты ферментативного гликозилированного альбумина для диагностики in vitro.
Меры предосторожности
При использовании или взвешивании надевайте защитные перчатки и очки и обеспечивайте хорошую вентиляцию после использования.Этот продукт может вызвать кожную аллергическую реакцию и серьезное раздражение глаз.При вдыхании он может вызвать симптомы аллергии, астмы или одышку.Может вызвать раздражение дыхательных путей.
Определение единицы измерения
Одна единица (Е) определяется как количество фермента, необходимое для гидролиза казеина с образованием 1 мкмоль.тирозина в минуту при следующих условиях.
Подготовка реагентов
Реагент I: 1 г молочного казеина растворяли в 50 мл 0,1 М раствора фосфата натрия (рН 8,0), инкубировали в воде при температуре 65-70 ℃ в течение 15 минут, перемешивали и растворяли, охлаждали водой, доводили гидроксидом натрия до рН 8,0 и фиксировали объем. 100мл.
Реагент II: 0,1 М трихлоруксусная кислота, 0,2 М ацетат натрия, 0,3 М уксусная кислота.
Реагент III: 0,4 М Na.2CO3решение.
Реагент IV: Реагент Форинт, разбавленный чистой водой в 5 раз.
Реагент V: Разбавитель фермента: 0,1 М раствор фосфата натрия (рН 8,0).
Реагент VI: раствор тирозина: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 мкмоль/мл тирозина, растворенного 0,2М HCl.
Процедура
1. 0,5 мл реагента I предварительно подогревают до 37℃, добавляют 0,5 мл раствора фермента, хорошо перемешивают и инкубируют при37℃ в течение 10 минут.
2. Добавьте 1 мл реагента II, чтобы остановить реакцию, хорошо перемешайте и продолжайте инкубацию в течение 30 минут.
3. Центрифугируйте реакционный раствор.
4. Возьмите 0,5 мл супернатанта, добавьте 2,5 мл реагента III, 0,5 мл реагента IV, хорошо перемешайте и инкубируйте при 37 ℃.на 30мин.
5. ОД660определялось как ОД1;пустая контрольная группа: 0,5 мл реагента V используется для замены фермента.раствор для определения ОД660как ОД2, ΔOD=OD1-ОД2.
6. Стандартная кривая L-тирозина: 0,5 мл раствора L-тирозина различной концентрации, 2,5 мл реагента III, 0,5 мл реагента IV в центрифужной пробирке объемом 5 мл, инкубировать при 37 ℃ в течение 30 минут, определить ОП.660для разных концентраций L-тирозина затем получили стандартную кривую Y=kX+b, где Y - концентрация L-тирозина, X - OD600.
Расчет
2: Общий объем реакционного раствора (мл).
0,5: Объем раствора фермента (мл).
0,5: Объем реакционной жидкости, использованный при хромогенном определении (мл).
10: Время реакции (мин)
Df: Многократное разбавление
C: Концентрация фермента (мг/мл)
Рекомендации
1. Вигер У и Хильц Х. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Вигер У и Хильц Х. Биохимия.Биофиз.Рез.Коммун.(1971);44:513.
3. Хильц, Х.и другие.,Евро.Дж. Биохим.(1975);56:103–108.
4. Сэмбрук Дж.et ал., Молекулярное клонирование: Лабораторное руководство, 2-е издание, Колд-Спринг-ХарборЛабораторное издательство, Колд-Спринг-Харбор (1989).
Цифры
инжир.1 Оптимум pH
100 мМ буферный раствор: pH 6,0-8,0, Na-фосфат;pH 8,0-9,0, Трис-HCl;pH 9,0–12,5, глицин-NaOH. Концентрация фермента: 1 мг/мл.
Рис.2 Оптимальная температура
Реакция в 20 мМ К-фосфатном буфере, pH 8,0.Концентрация фермента: 1 мг/мл
Рис.3 pH Стабильность
25 ℃, 16 ч. Обработка 50 мМ буферным раствором: pH 4,5–5,5, ацетат;pH 6,0-8,0, Na-фосфат;pH 8,0-9,0, Трис-HCl.pH 9,0-12,5, Глицин-NaOH.Концентрация фермента: 1 мг/мл
Рис.4 Термический стабильность
30-минутная обработка 50 мМ трис-HCl-буфером, pH 8,0.Концентрация фермента: 1 мг/мл
Рис.5 Хранение стабильныйty at 25℃
