2 × Sensi Direct Premix-UNG (зонд кПЦР)
Кат. номер: HCB5151A
SensiDirect Premix-UNG (Probe qPCR) предназначен для проведения ПЦР непосредственно из образцов без экстракции ДНК или подготовки образцов.Этот реагент состоит из ДНК-полимеразы горячего старта, урацил-ДНК-гликозилазы (UNG), ингибитора РНКазы, MgCl.2, dNTP (с dUTP вместо dTTP) и стабилизаторы для количественной ПЦР (кПЦР).Этот реагент обеспечивает высокую толерантность к ингибиторам, и поэтому его можно непосредственно применять для обнаружения таких образцов, как мазки из зева, слюна, антикоагулянтная цельная кровь, плазма и сыворотка, без экстракции ДНК.В реагенте используется запатентованный буфер для кПЦР со смесью ферментов антиингибирующей ДНК-полимеразы и фермента УНГ.Таким образом, он может обеспечить хорошую амплификацию целевых генов в образцах, содержащих ингибиторы, и ингибировать ложноположительную амплификацию, вызванную остатками ПЦР и аэрозольным загрязнением.Этот реагент совместим с большинством флуоресцентных инструментов для количественной ПЦР, таких как Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad, Roche и так далее.
Компоненты
1. 50×смесь ферментов SensiDirect/UNG
2. 2 × премикс-буфера SensiDirect (dUTP)
Условия хранения
Все компоненты следует хранить при температуре -20℃ при длительном хранении и при температуре 4℃ до 3 месяцев.Пожалуйста, тщательно перемешайте после оттаивания и центрифугируйте перед использованием.Избегайте частого замораживания-оттаивания.
Велосипедный протокол
| Шаг | Температура | Время | Цикл |
| Пищеварение | 50℃ | 2мин | 1 |
| Активация полимеразы | 95℃ | 1-5 минут | 1 |
| Денатурация | 95℃ | 10–20 секунд | 40-50 |
| Отжиг/Расширение | 56-64℃ | 20-60-е годы |
Инструкции по пипетированию
| Реагент | Объем на реакция | Объем на реакцию | Окончательная концентрация |
| 2 × премикс-буфера SensiDirect (dUTP) | 12,5 мкл | 25 мкл | 1× |
| 50 × Смесь ферментов SensiDirect/UNG | 0,5 мкл | 1 мкл | 1× |
| 25×смесь праймер-зонд1, 2 | 1 мкл | 2 мкл | 1× |
| Образец3, 4 | - | - | - |
| ддх2O | - | - | - |
| Общий объем | 25 мкл | 50 мкл | - |
1. Конечная концентрация праймера обычно составляет 0,2 мкм.Для достижения лучших результатов концентрацию праймера можно оптимизировать в диапазоне 0,2–1 мкм.
2. Как правило, концентрацию зонда можно оптимизировать в диапазоне 0,1–0,3 мкм.Оптимальная концентрация зонда зависит от инструмента для ПЦР-амплификации в реальном времени, типа зонда и типа флуоресцентного меченого вещества.Пожалуйста, обратитесь к руководству по эксплуатации прибора или к конкретным требованиям каждого флуоресцентного зонда.
3. Различные типы образцов содержат разные типы и содержание ингибитора, а также количество копий целевого гена.Объем выборки следует учитывать в зависимости от фактического состояния.При необходимости разведите образец, добавив воду, не содержащую нуклеаз, или буфер TE.
4. Рекомендуемый объем различных образцов:
| Образец | Объем на одного 50 мкл реакция | Максимум соотношение |
| Антикоагулянтная цельная кровь | 2,5 мкл | 5% |
| Плазма | 15 мкл | 30% |
| сыворотка | 10 мкл | 20% |
| мазок из горла | 10 мкл | 20% |
| Слюна | 10 мкл | 20% |
Контроль качества
1. Функция обнаружения: чувствительность, специфичность и повторяемость qPCR.
2. Отсутствие экзогенной нуклеазной активности: отсутствие экзогенной эндонуклеазы и экзонуклеазного загрязнения.
Примечания к продукту
1. В этом продукте используется новый тип ДНК-полимеразы с горячим стартом, которую можно активировать за 1-5 минут. Поскольку реакционный буфер оптимизирован, он больше подходит для количественной ПЦР с двойной или множественной флуоресценцией с использованием зондового метода.
2. Если значение Rn амплификации ПЦР слишком низкое или амплификация явно ингибируется, уменьшение количества образца, увеличение объема реакции или предыдущее разведение образца могут улучшить результаты.
3. Сбор крови, слюны, мочи, мазков из зева и т. д. должен соответствовать требованиям клинических критериев, а свежие образцы могут использоваться для предотвращения деградации нуклеиновых кислот.
4. Поскольку разные ампликоны имеют разную эффективность использования dUTP и чувствительность к UNG, реагенты следует оптимизировать, если чувствительность обнаружения снижается при использовании системы UNG.При необходимости свяжитесь с нами для получения технической поддержки.
5. Чтобы избежать амплификации продуктов ПЦР-переноса между одноэтапными реакциями, для амплификации требуется выделенная экспериментальная зона и пипетка.Работайте в перчатках, часто меняйте их и не открывайте реакционную пробирку после ПЦР-амплификации.
