Обратная транскриптаза RTL
Обратная транскриптаза RTL представляет собой ДНК-полимеразу, зависимую от матрицы РНК, которая лишена экзонуклеазной активности 3'→5' и обладает активностью РНКазы H.Этот фермент может использовать РНК в качестве матрицы для синтеза комплементарной цепи ДНК, которую можно применять для синтеза первой цепи кДНК, особенно для RT-LAMP (петлевая изотермическая амплификация).По сравнению с обратной транскриптазой RTL 1.0 чувствительность значительно улучшена, термическая стабильность выше, а реакция при 65°C более стабильна.Обратная транскриптаза RTL (без глицерина) может быть использована для приготовления лиофилизированных препаратов, лиофилизированных реагентов RT-LAMP и т. д.
Определение единицы измерения
Одна единица включает 1 нмоль dTTP в осаждаемый кислотой материал за 20 минут при 50°C с использованием поли(А)•олиго(dT)25 в качестве матрицы-праймера.
Компоненты
| Компонент | ХК5008A-01 | ХК5008A-02 | ХК5008A-03 |
| Обратная транскриптаза RTL (без глицерина) (15 ЕД/мкл) | 0,1 мл | 1 мл | 10 мл |
| 10×HC RTL-буфер | 1,5 мл | 4×1,5 мл | 5×10 мл |
| MgSO4 (100 мМ) | 1,5 мл | 2×1,5 мл | 3×10 мл |
Условия хранения
Транспортировать при температуре 0°C и хранить при температуре -25°C~-15°C.
Контроль качества
- Остаточная активностьEндонуклеаза:Реакция объемом 50 мкл, содержащая 1 мкг λДНК и 15 единиц RTL2.0, инкубированная в течение 16 часов при 37 ℃, демонстрирует ту же картину, что и отрицательный контроль с помощью гель-электрофореза.
- Остаточная активностьЭкзонуклеаза:Реакция объемом 50 мкл, содержащая 1 мкг расщепленной Hind Ⅲ λ-ДНК и 15 единиц RTL2.0, инкубированная в течение 16 часов при 37 ℃, демонстрирует ту же картину, что и отрицательный контроль с помощью гель-электрофореза.
- Остаточная активностьНикасе:Реакционная смесь объемом 50 мкл, содержащая 1 мкг сверхспиральной pBR322 и 15 единиц RTL2.0, инкубированная в течение 4 часов при 37°C, демонстрирует ту же картину, что и отрицательный контроль при гель-электрофорезе.
- Остаточная активностьРНКаза:Реакция объемом 10 мкл, содержащая 0,48 мкг РНК MS2 и 15 единиц RTL2.0, инкубированная в течение 4 часов при 37°C, демонстрирует ту же картину, что и отрицательный контроль при гель-электрофорезе.
- кишечная палочка gДНК:Измерено скишечная палочкаспециальные комплекты обнаружения HCD, 15 единиц RTL2.0 содержат менее 1кишечная палочкагеном.
Настройка реакции
Протокол синтеза кДНК
| Компоненты | Объем |
| Матричная РНК а | необязательный |
| Олиго(dT) 18~25 (50мкМ) или случайная смесь праймеров (60мкМ) | 2 мкл |
| Смесь дНТФ (по 10 мМ каждый) | 1 мкл |
| Ингибитор РНКазы (40 ЕД/мкл) | 0,5 мкл |
| Обратная транскриптаза RTL 2.0 (15 ЕД/мкл) | 0,5 мкл |
| 10×HC RTL-буфер | 2 мкл |
| Безнуклеазная вода | До 20 мкл |
Примечания:
1) Рекомендуемая дозировка тотальной РНК составляет 1 нг~1 мкг.
2) Рекомендуемая дозировка мРНК составляла 50–100 нг.
Термо-Условия для езды на велосипеде реакция:
| Температура (°С) | Время |
| 25 °Сa | 5 минут |
| 55 °С | 10 минутb |
| 80 °С | 10 минут |
Примечания:
1) Если используется случайная смесь праймеров, этап инкубации осуществляется при 25°C.
2) Если используется смесь целевых праймеров, этап инкубации при 55°C в течение 10–30 минут.
Протокол RT-LAMP
| Компоненты | Объем | Окончательная концентрация |
| Шаблонная РНК | необязательный | ≥10 копий |
| Смесь дНТФ (10 мМ) | 3,5 мкл | 1,4 мм |
| Праймеры FIP/BIP (25 ×) | 1 мкл | 1,6 мкм |
| Праймеры F3/B3 (25×) | 1 мкл | 0,2 мкм |
| Праймеры LoopF/LoopB (25 ×) | 1 мкл | 0,4 мкм |
| Ингибитор РНКазы (40 ЕД/мкл) | 0,5 мкл | 20 ед./реакция |
| Обратная транскриптаза RTL 2.0 (15 ЕД/мкл) | 0,5 мкл | 7.5 Е/реакция |
| ДНК-полимераза Bst V2 (8U/мкл) | 1 мкл | 8 Е/Реакция |
| MgSO4 (100 мМ) | 1,5 мкл | 6 мМ (всего 8 мМ) |
| 10 × буфер HC RTL (или 10 × буфер HC Bst V2) | 2,5 мкл | 1 × (2мМ Mg2+) |
| Безнуклеазная вода | До 25 мкл | - |
Примечания:
1) Перемешать встряхиванием и кратковременно центрифугировать для сбора.Инкубация при постоянной температуре 65°С в течение 1 часа.
2) Два буфера совместимы и имеют одинаковый состав.
Примечания
1. Этот продукт образует белое твердое вещество при хранении при температуре -20 °C.Достаньте его из -20°C и положите на лед примерно на 10 минут.После плавления его можно использовать, встряхивая и перемешивая.
2. Продукт кДНК можно хранить при -20°C или -80°C или сразу использовать для реакции ПЦР.
3. Чтобы предотвратить загрязнение РНКазой, поддерживайте чистоту экспериментальной зоны и надевайте чистые перчатки и маски во время работы.
