Универсальный премикс для кПЦР SYBR GREEN (синий)
Кат. номер: HCB5041B
Universal Blue qPCR Master Mix (на основе красителя) представляет собой предварительный раствор для двукратной количественной ПЦР-амплификации в реальном времени, характеризующийся высокой чувствительностью и специфичностью, синего цвета и эффектом отслеживания добавления образца.Основной компонент ДНК-полимеразы Taq использует горячий старт антител для эффективного ингибирования неспецифической амплификации вследствие отжига праймера во время подготовки образца.В то же время в формулу добавлены стимулирующие факторы для повышения эффективности амплификации реакции ПЦР и выравнивания амплификации генов с различным содержанием GC (30 ~ 70%), так что количественная ПЦР может получить хорошую линейную зависимость в широком количественном диапазоне. область, край.Этот продукт содержит специальный пассивный эталонный краситель ROX, который применим к большинству приборов для количественной ПЦР.Нет необходимости регулировать концентрацию ROX на разных приборах.Добавлять праймеры и матрицы необходимо только для подготовки реакционной системы к амплификации.
Компоненты
Универсальный синий мастер-микс для количественной ПЦР
Условия хранения
Продукт поставляется в пакетах со льдом и может храниться при температуре -25℃~-15℃ в течение 18 месяцев.Необходимо избегать сильного светового облучения при хранении или приготовлении реакционной системы.
Спецификация
| Концентрация | 2× |
| Метод обнаружения | СИБР |
| ПЦР-метод | кПЦР |
| Полимераза | ДНК-полимераза Taq |
| Тип образца | ДНК |
| Оборудование для нанесения | Большинство инструментов qPCR |
| Тип продукта | Премикс SYBR для количественной флуоресцентной ПЦР в реальном времени |
| Подать заявку на (приложение) | Экспрессия генов |
инструкции
1. Система реакции
| Компоненты | Объем (мкл) | Объем (мкл) | Окончательная концентрация |
| Универсальный премикс для кПЦР SYBR GREEN | 25 | 10 | 1× |
| Форвард Праймер (10 мкмоль/л) | 1 | 0,4 | 0,2 мкмоль/л |
| Обратный праймер (10 мкмоль/л) | 1 | 0,4 | 0,2 мкмоль/л |
| ДНК | X | X | |
| ддх2O | До 50 | до 20 | - |
[Примечание]: Тщательно перемешайте перед использованием, чтобы избежать образования чрезмерных пузырьков при энергичном встряхивании.
а) Концентрация праймера: Конечная концентрация праймера составляет 0,2 мкмоль/л, ее также можно регулировать в пределах от 0,1 до 1,0 мкмоль/л в зависимости от ситуации.
б) Концентрация матрицы: если матрица представляет собой неразбавленный исходный раствор кДНК, используемый объем не должен превышать 1/10 от общего объема реакции qPCR.
в) Разведение матрицы: рекомендуется разбавлять исходный раствор кДНК в 5-10 раз.Оптимальное количество добавленного шаблона лучше, когда значение Ct, полученное путем амплификации, составляет 20-30 циклов.
г) Реакционная система: рекомендуется использовать 20 мкл или 50 мкл, чтобы обеспечить эффективность и повторяемость амплификации целевого гена.
д) Подготовка системы: подготовьтесь на сверхчистом столе и используйте наконечники и реакционные пробирки без остатков нуклеазы;рекомендуется использовать насадки с фильтрующими картриджами.Избегайте перекрестного загрязнения и аэрозольного загрязнения.
2.Программа реагирования
Стандартная программа
| Шаг цикла | Темп. | Время | Циклы |
| Начальная денатурация | 95℃ | 2 мин | 1 |
| Денатурация | 95℃ | 10 секунд | 40 |
| Отжиг/Расширение | 60℃ | 30 секунд★ | |
| Стадия кривой плавления | Настройки инструмента по умолчанию | 1 | |
Быстрая программа
| Шаг цикла | Темп. | Время | Циклы |
| Начальная денатурация | 95℃ | 30 секунд | 1 |
| Денатурация | 95℃ | 3 секунды | 40 |
| Отжиг/Расширение | 60℃ | 20 секунд★ | |
| Стадия кривой плавления | Настройки инструмента по умолчанию | 1 | |
[Примечание]: быстрая программа подходит для подавляющего большинства генов, а стандартные программы можно опробовать для отдельных генов сложной вторичной структуры.
а) Температура и время отжига: регулируйте в зависимости от длины праймера и целевого гена.
б) Получение сигнала флуоресценции (★): Установите процедуру эксперимента в соответствии с требованиями инструкции по использованию прибора.
в) Кривая плавления: стандартную программу прибора можно использовать в обычном режиме.
3. Анализ результатов
Для количественных экспериментов требовалось минимум три биологических повтора.После реакции необходимо подтвердить кривую амплификации и кривую плавления.
3.1 Кривая усиления:
Стандартная кривая усиления имеет S-образную форму.Количественный анализ наиболее точен, когда значение Ct находится в пределах от 20 до 30. Если значение Ct меньше 10, необходимо разбавить шаблон и провести тест еще раз.Когда значение Ct находится в пределах 30-35, необходимо увеличить концентрацию матрицы или объем реакционной системы, чтобы повысить эффективность амплификации и обеспечить точность анализа результатов.Когда значение Ct превышает 35, результаты теста не могут количественно проанализировать экспрессию гена, но могут быть использованы для качественного анализа.
3.2 Кривая плавления:
Одиночный пик на кривой плавления указывает на то, что специфичность реакции хорошая и можно провести количественный анализ;если кривая плавления показывает двойные или множественные пики, количественный анализ провести невозможно.Кривая плавления показывает двойные пики, и необходимо судить, является ли нецелевой пик димером праймера или неспецифической амплификацией с помощью электрофореза ДНК в агарозном геле.Если это димер праймера, рекомендуется уменьшить концентрацию праймера или перепроектировать праймеры с высокой эффективностью амплификации.Если это неспецифическая амплификация, увеличьте температуру отжига или измените специфичность праймеров.
Примечания
Пожалуйста, надевайте необходимые средства индивидуальной защиты, такие как лабораторный халат и перчатки, чтобы обеспечить свое здоровье и безопасность！
Этот продукт предназначен ТОЛЬКО для исследовательского использования!
