Набор для прямой ПЦР растений

Кат. номер: HCR2020A

Набор Plant Direct PCR Kit подходит для прямой амплификации листьев, семян и т. д. растений и может использоваться для высокопроизводительного скрининга образцов растений, не содержащих полисахаридов и полифенолов.ДНК-полимераза прямой амплификации, основанная на направленной эволюции, обладает превосходной толерантностью к ингибиторам ПЦР в растениях.При этом он сохраняет высокую производительность амплификации, подходящую для амплификации фрагментов ДНК размером до 5 т.п.н.Уникальный буфер для лизиса А, входящий в комплект, можно использовать для лизирования свежих или замороженных растительных тканей.С ним легко работать, а лизат можно использовать в качестве матрицы для амплификации без очистки.Система содержит защитные вещества, которые позволяют эффективно амплифицировать образцы сырой нефти после многократного замораживания и оттаивания.В 2 × Plant Direct Master Mix требуется только добавить праймеры и шаблоны для проведения реакции амплификации, тем самым сокращая операции пипетирования и улучшая производительность обнаружения и воспроизводимость результатов.

Компоненты

*Plant Direct Lysis Buffer B — это дополнительный реагент, который используется для нейтрализации Plant Direct Lysis Buffer A для продления времени хранения образцов.Его можно использовать в соответствии с реальной ситуацией.

Условия хранения

2 × Plant Direct Master Mix, хранить при температуре от -30 до -15℃ и избегать повторного замораживания и оттаивания;Буфер для прямого лизиса растений, хранить при температуре -30 ~ -15 ℃ или 2 ~ 8 ℃.

Процесс эксперимента

Образец обработки–Лист растения

Прямой метод:Рекомендуется использовать молодые листья.Используйте дырокол фиксированного диаметра 0,5–3 мм, чтобы получить небольшой и однородный образец, а затем непосредственно добавляйте образец в систему ПЦР (рекомендуется система на 50 мкл).Обратите внимание: убедитесь, что образец находится в растворе для ПЦР, а не упирается в стенку пробирки.Если для амплификации длинных фрагментов и сложных образцов используется прямая ПЦР, использование образца меньшего диаметра (0,5–1 мм) в качестве матрицы может помочь получить лучшие результаты.

Метод измельчения лизиса:Рекомендуется использовать молодые листья.Возьмите небольшой кусочек листа (около 1–3 мм в диаметре), поместите его в 20 мкл Plant Direct Lysis Buffer Ab и измельчите его как можно сильнее (этот шаг можно выполнить, сжимая лист кончиком пипетки емкостью 100 мкл). размять образец).Если используются большие объемы ткани листьев (не превышают 7 мм), увеличьте объем буфера для разведения до 50 мкл.После измельчения листьев раствор должен стать зеленым.После непродолжительного центрифугирования добавьте 1 мкл супернатанта в систему ПЦР в качестве шаблона реакции.

Метод термического лизиса:Рекомендуется использовать молодые листья.Возьмите небольшой кусочек листа (около 1–3 мм в диаметре), поместите его в 20 мкл буфера для прямого лизиса растений А и нагрейте при 95°C в течение 5–10 мин.Время лизиса может быть соответствующим образом увеличено для листьев, которые трудно лизируются (не более 20 мин).Если используются большие объемы ткани листьев (не превышают 7 мм), увеличьте объем буфера для разведения до 50 мкл.После нагревания кратковременно центрифугируйте и добавьте 1 мкл супернатанта в систему ПЦР в качестве шаблона реакцииb.

Образец обработки–Семена растений

Метод измельчения лизиса:С помощью скальпеля разрежьте семена диаметром 5 мм, добавьте их к 100 мкл буфера для прямого лизиса растений А и измельчите образец кончиком пипетки или другими инструментами.Кратковременно перемешайте и дайте постоять при комнатной температуре 3–5 минут.Убедитесь, что образец семян погружен в буфер для разведения.После непродолжительного центрифугирования добавьте 1 мкл супернатанта в систему ПЦР в качестве шаблона реакции.

Метод термического лизиса:Скальпелем нарежьте семена диаметром 5 мм, добавьте их в 100 мкл буфера для прямого лизиса растений А и нагревайте при 95°C в течение 5–10 мин.Время лизиса можно соответствующим образом увеличить для листьев, которые трудно лизировать (не более 30 мин).После нагревания кратковременно центрифугируйте и добавьте 1 мкл супернатанта в систему ПЦР в качестве шаблона реакцииb.

а.Ножницы или другие инструменты также можно использовать для вырезания образцов подходящего размера;Если перфоратор или ножницы используются повторно, их следует очищать 2% раствором гипохлорита натрия перед каждым использованием, чтобы предотвратить перекрестное загрязнение между образцами.

б.Перед использованием убедитесь, что буфер для прямого лизиса растений полностью расплавлен.Если буфер вязкий или имеет осадок, его можно нагреть до 37 ℃, чтобы полностью расплавить перед использованием.

в.Объем шаблона в реакционной системе можно соответствующим образом отрегулировать в зависимости от разницы в объеме добавленного растительного материала и разбавителя.

Растительный буфер для прямого лизиса

Буфер А для прямого лизиса растений, содержащийся в этом продукте, был строго оптимизирован для высвобождения генома большинства растительных тканей и подходит для кратковременного хранения необработанных растений при температуре 4 ℃.Если образец необходимо хранить в течение более длительного периода времени (например, 1–2 месяца), рекомендуется переместить надосадочную жидкость в новую EP-пробирку и хранить ее при -20 ℃.Для более стабильного хранения образцов добавьте к перенесенному супернатанту равный объем Plant Direct Lysis Buffer B, хорошо перемешайте и храните при -20 ℃.Срок стабильного хранения зависит от образцов и состояний растений.

Реакционная система

а.Содержит магний²⁺в конечной концентрации 2 мМ.

б.Рекомендуется использовать конечную концентрацию 0,4 мкм для каждого праймера.Чрезмерное использование праймеров приведет к увеличению неспецифической амплификации.

в.Количество используемого образца можно регулировать в зависимости от реальной ситуации.Количество, используемое в одной реакции неочищенного лизированного образца, можно регулировать в пределах 2–20 % от общего объема реакции.Использование слишком большого количества образцов может привести к сбою усиления.

Программа реагирования

а.Начальная денатурация (98 ℃, 5 мин) способствует лизису растительной ткани, высвобождая геномную ДНК, которую можно использовать для ПЦР-амплификации.Не сокращайте время и не снижайте температуру.

б.Рекомендуется установить его равным значению Tm праймера или на 2 ~ 4 ℃ выше значения Tm.ДНК-полимераза прямой амплификации, используемая в этом продукте, отличается от обычной ДНК-полимеразы Taq и предъявляет особые требования к температуре реакционного отжига; использование высокой температуры отжига может эффективно снизить неспецифическую амплификацию и повысить эффективность амплификации.Для сложных шаблонов эффективная амплификация может быть достигнута путем регулирования температуры отжига и увеличения времени растяжения.

в.Если длина продукта амплификации составляет ≤1 кб, время расширения устанавливается равным 30 с/кб;если длина продукта амплификации >1 кб, время расширения устанавливается равным 60 сек/кб.

д.Для сложных образцов или образцов с низким выходом амплификации количество циклов можно соответствующим образом увеличить до 40–50 циклов.

Приложения

Он применим для прямой амплификации растительных тканей и высокопроизводительного скрининга образцов растений, не содержащих полисахаридов и полифенолов.

Примечания

Только для исследовательского использования.Не для использования в диагностических процедурах.

1. Для амплификации сырого растения или прямой амплификации рекомендуется использовать очищенную геномную ДНК в качестве положительного контроля перед началом эксперимента, чтобы убедиться в правильности системы, праймеров и операций.

2. ДНК-полимераза прямой амплификации, используемая в этом наборе, обладает сильной корректирующей активностью.Если необходимо выполнить клонирование ТА, рекомендуется очистить ДНК перед добавлением аденина.

3. Руководство по проектированию праймера:

а.Рекомендуется, чтобы последнее основание на 3'-конце праймера было G или C.

б.Следует избегать последовательных несовпадений в последних 8 основаниях на 3'-конце праймера.в.Избегайте образования шпилек на 3'-конце праймера.

д.Разница в значении Tm прямого праймера и обратного праймера должна составлять не более 1 ℃, а значение Tm должно быть отрегулировано до 60 ~ 72 ℃ (для расчета значения Tm рекомендуется использовать Primer Premier 5).

е.Дополнительные дополнительные последовательности праймеров, которые не совпадают с матрицей, не следует включать в расчет значения Tm праймера.

ф.Рекомендуется, чтобы содержание GC в праймере составляло 40–60%.

г.Общее распределение A, G, C и T в праймере должно быть как можно более равномерным.Избегайте использования регионов с высоким содержанием GC или AT.

часИзбегайте присутствия комплементарных последовательностей из 5 или более оснований внутри праймера или между двумя праймерами, а также избегайте присутствия комплементарных последовательностей из 3 или более оснований на 3'-конце двух праймеров.

я.Используйте функцию NCBI BLAST, чтобы проверить специфичность праймера и предотвратить неспецифическую амплификацию.