Протеиназа К NGS (порошок)
Кат. номер: HC4507A
NGS Protease K представляет собой стабильную сериновую протеазу с высокой ферментативной активностью и широкой субстратной специфичностью. Фермент преимущественно расщепляет сложноэфирные связи и пептидные связи, прилегающие к С-концу гидрофобных аминокислот, серосодержащих аминокислот и ароматических аминокислот.Поэтому его часто используют для расщепления белков на короткие пептиды.NGS Protease K — типичная сериновая протеаза с Asp.39-Его69-Сир224каталитическая триада, уникальная для сериновых протеаз, каталитический центр окружен буксиром Ca2+сайты связывания для стабилизации, поддержания высокой активности фермента в более широком диапазоне условий.
Спецификация
| Появление | Аморфный порошок от белого до почти белого цвета, лиофилизированный. |
| Конкретная деятельность | ≥40 ЕД/мг твердого вещества |
| ДНКаза | Ничего не обнаружено |
| РНКаза | Ничего не обнаружено |
| Бионагрузка | ≤50 КОЕ/г твердого вещества |
| Остаток нуклеиновой кислоты | <5 пг/мг твердого вещества |
Характеристики
| Источник | Тритирахий альбом |
| Номер ЕС | 3.4.21.64(Рекомбинант из альбома Tritirachium) |
| Молекулярная масса | 29 кДа (SDS-СТР.) |
| Изоэлектрическая точка | 7.81 Рис.1 |
| Оптимальный pH | 7,0-12,0 (Все проявляют высокую активность) Рис.2 |
| Оптимальная температура | 65℃ Рис.3 |
| Стабильность pH | pH 4,5–12,5 (25℃, 16 ч) Рис.4 |
| Термическая стабильность | Ниже 50℃ (pH 8,0, 30 мин) Рис.5 |
| Стабильность хранения | Хранится при температуре 25℃ в течение 12 месяцев Рис.6. |
| Активаторы | ДСН, мочевина |
| Ингибиторы | Диизопропилфторфосфат;бензилсульфонилфторид |
Условия хранения
Храните лиофилизированный порошок при температуре -25 ~ -15 ℃ в течение длительного времени в защищенном от света месте;После растворения разлейте аликвоту в соответствующий объем для кратковременного хранения при температуре 2–8 ℃ в защищенном от света месте или длительного хранения при температуре -25–15 ℃ в защищенном от света месте.
Меры предосторожности
При использовании или взвешивании надевайте защитные перчатки и очки и обеспечивайте хорошую вентиляцию после использования.Этот продукт может вызвать кожную аллергическую реакцию и серьезное раздражение глаз.При вдыхании он может вызвать симптомы аллергии, астмы или одышку.Может вызвать раздражение дыхательных путей.
Определение единицы измерения
Одна единица NGS протеазы K определяется как количество фермента, необходимое для гидролиза казеина до 1 мкмоль L-тирозина в стандартных условиях определения.
Подготовка реагентов
| Реагент | Производитель | Каталог |
| Казеин техническийиз коровьего молока | Сигма Олдрич | C7078 |
| NaOH | Синофарм КемикалКомпания Реагент, ООО | 10019762 |
| Неа2PO4·2 часа2O | Синофарм КемикалКомпания Реагент, ООО | 20040718 |
| Na2HPO4 | Синофарм КемикалКомпания Реагент, ООО | 20040618 |
| Трихлоруксусная кислота | Синофарм КемикалКомпания Реагент, ООО | 80132618 |
| Ацетат натрия | Синофарм КемикалКомпания Реагент, ООО | 10018818 |
| Уксусная кислота | Синофарм КемикалКомпания Реагент, ООО | 10000218 |
| HCl | Синофарм КемикалКомпания Реагент, ООО | 10011018 |
| Карбонат натрия | Синофарм КемикалКомпания Реагент, ООО | 10019260 |
| Фолин-фенол | Сангон Биотех (Шанхай)Компания с ограниченной ответственностью. | А500467-0100 |
| L-тирозин | Сигма | 93829 |
Реагент I:
Субстрат: 1% раствор казеина из коровьего молока: 1 г казеина из бычьего молока растворить в 50 мл 0,1 М раствора фосфата натрия, pH 8,0, нагреть на водяной бане при 65-70 °C в течение 15 минут, перемешать и растворить, охладить водой, довести до нормы. гидроксида натрия до pH 8,0 и разбавьте до 100 мл.
Реагент II:
Раствор ТСА: 0,1 М трихлоруксусной кислоты, 0,2 М ацетата натрия и 0,3 М уксусной кислоты (взвесьте последовательно 1,64 г трихлоруксусной кислоты + 1,64 г ацетата натрия + 1,724 мл уксусной кислоты, добавьте 50 мл деионизированной воды, доведите pH до 4,03 с помощью HCl и разбавьте 100 мл).
Реагент III:
0,4 мл раствора карбоната натрия (взвесить 4,24 г безводного карбоната натрия и растворить в 100 мл воды)
Реагент IV:
Феноловый реактив Фолин: разбавить в 5 раз деионизированной водой.
Реагент V:
Разбавитель фермента: 0,1 М раствор фосфата натрия, pH 8,0.
Реагент VI:
Стандартный раствор L-тирозина: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 мкмоль/мл L-тирозин, растворенный в 0,2 М HCl.
Процедура
1. Включите спектрофотометр УФ-Вид и выберите фотометрическое измерение.
2. Установите длину волны 660 нм.
3. Включите водяную баню, установите температуру 37 ℃ и обеспечьте неизменность температуры в течение 3–5 минут.
4. Предварительно нагрейте субстрат объемом 0,5 мл в центрифужной пробирке объемом 2 мл на водяной бане при температуре 37 ℃ в течение 10 минут.
5. Экстрагируйте 0,5 мл разбавленного раствора фермента в предварительно нагретую центрифужную пробирку на 10 минут.Установите ферментный разбавитель в качестве пустой группы.
6. Добавьте 1,0 мл реагента ТСА сразу после реакции.Хорошо перемешайте и инкубируйте на водяной бане 30 минут.
7. Центрифугируйте реакционный раствор.
8. Добавьте следующие компоненты в указанном порядке.
| Реагент | Объем |
| Супернатант | 0,5 мл |
| 0,4 М карбонат натрия | 2,5 мл |
| Фолин феноловый реактив | 0,5 мл |
9. Тщательно перемешайте перед инкубацией на водяной бане при температуре 37℃ в течение 30 минут.
10. ОД660определялось как ОД1;Пустая контрольная группа: вместо раствора фермента для определения OD используется ферментный разбавитель.660как ОД2, ΔOD=OD1-ОД2.
11. Стандартная кривая L-тирозина: 0,5 мл раствора L-тирозина различной концентрации, 2,5 мл 0,4 М карбоната натрия, 0,5 мл фенольного реагента Фолина в центрифужной пробирке объемом 5 мл, инкубировать при 37 ℃ в течение 30 минут, определить ОП.660для разных концентраций L-тирозина затем получили стандартную кривую Y=kX+b, где Y - концентрация L-тирозина, X - OD600.
Расчет
2: Общий объем реакционного раствора (мл).
0,5: Объем раствора фермента (мл).
0,5: Объем реакционной жидкости, использованный при хромогенном определении (мл).
10: Время реакции (мин)
Df: Многократное разбавление
C: Концентрация фермента (мг/мл)
Цифры
Рис.1 Остаток ДНК
| Образец | авеню C4 | Нуклеиновая кислота Восстановление (пг/мг) | Восстановление(%) | Всего нуклеиновых Кислота ( пг/мг) |
| ФРК | 24.66 | 2.23 | 83% | 2,687 |
| ФРК+СТД2 | 18,723 | 126,728 | — | — |
| СТД1 | 12.955 |
— |
— |
— |
| СТД2 | 16 | |||
| СТД3 | 19.125 | |||
| СТД4 | 23.135 | |||
| СТД5 | 26,625 | |||
| H2O без РНК | Неопределенный | — | — | — |
Рис.2 Оптимальный pH
Рис.3 Оптимальная температура
Рис.4 Стабильность pH
Рис.5 Термическая стабильность
Рис.6 Стабильность хранения при 25 ℃
