Набор EndoFree Plasmid Maxi

Условия хранения

РНКазу А следует хранить при температуре от -30 до -15 ℃ и транспортировать при температуре ≤0 ℃.

Endotoxin Scavenger можно хранить при температуре 2 ~ 8 ℃ в течение одного месяца, хранить при температуре -30 ~ -15 ℃ для длительного хранения.и транспортируется при температуре ≤0℃.

Другие компоненты следует хранить при комнатной температуре (15–25 ℃) и транспортировать при комнатной температуре.

Компоненты

РНКазаА:10 мг/мл, используется для удаления РНК.

Буфер P1:буфер бактериальной суспензии, добавьте РНКазу А в буфер P1 перед первым использованием.

Буфер P2:буфер для бактериального лизиса (содержащий SDS/NaOH).

Буфер P4:нейтрализующий буфер.

Поглотитель эндотоксинов:эффективно удалять эндотоксин из сырого экстракта плазмиды.

Буферная мощность:промывочный буфер, перед первым использованием добавьте предусмотренный объем этанола.

Буферный туберкулез:элюирующий буфер.

Колонки FastPure DNA Maxi:адсорбционные колонки плазмидной ДНК.

Пробирки для сбора 50 мл:пробирки для сбора фильтрата.

Пробирка для сбора без эндотоксинов:пробирки для сбора плазмидной ДНК.

Подготовленные материалы

Абсолютный этанол, изопропанол, круглодонные центрифужные пробирки объемом 50 мл и не содержащие эндотоксинов 50 мл.центрифужные пробирки.

Приложения

Этот продукт подходит для крупномасштабной экстракции плазмид из 150–300 мл бактериального раствора.культивируют в течение ночи.

Процесс эксперимента

1. Взять 150 – 200 мл (не более 300 мл) раствора бактерий, культивируемых в течение ночи, и центрифугировать приоколо 11 000 об/мин (12 000 × g) в течение 1–2 мин.Отбросьте супернатант и соберите бактерии.

Δ При сборе более 50 мл бактериального раствора бактерии можно собрать путем добавления бактериального раствора, центрифугирования, удаления надосадочной жидкости и других этапов в одну и ту же пробирку емкостью 50 мл.

много раз.

2. Добавьте 7,5 мл буфера P1 (проверьте, была ли добавлена ​​РНКаза А в буфер P1) в центрифугу.пробирку, содержащую бактерии, и тщательно перемешайте вортексом или пипеткой.

Δ Полное ресуспендирование бактерий на этом этапе имеет решающее значение для выхода продукта, и после ресуспендирования не должно оставаться бактериальных комков.Если есть бактериальные комки, которые не тщательно перемешаны, это повлияет на лизис, что приведет к низкому выходу и чистоте.Если OD600 бактериального раствора составляет 0,65, рекомендуется использовать 7,5 мл буфера P1 при экстракции из 150 мл бактериального раствора;когда OD600 составляет 0,75, следует использовать 8 мл буфера P1 и соответствующим образом изменить объемы буферов P2 и P4.Если объем бактериального раствора увеличить до 200 мл, рекомендуетсяобъем буферов P1, P2 и P4 пропорционально увеличивается.

3. Добавьте 7,5 мл буфера P2 к бактериальной суспензии, полученной на этапе 2, и осторожно перемешивайте вверх и вниз в течение 6–8 минут.раз и инкубируйте при комнатной температуре 4–5 мин.

Δ Аккуратно переверните, чтобы тщательно перемешать.Встряхивание приведет к фрагментации геномной ДНК, в результате чего в экстрагированной плазмиде появятся фрагменты геномной ДНК.В это время раствор становится вязким и полупрозрачным, показывая, что бактерии полностью лизированы.Продолжительность не должна превышать 5 минут, чтобы избежать разрушения плазмид.Если раствор непрозрачный, возможно, в нем слишком много бактерий, что приводит кнеполный лизис, поэтому количество бактерий следует соответствующим образом уменьшить.

4. Добавьте 7,5 мл буфера P4 к бактериальной суспензии, полученной на этапе 3, и сразу же осторожно переверните 6–8 раз, чтобы раствор полностью нейтрализовал буфер P2.В это время должен выпасть белый хлопьевидный осадок.Центрифугируйте со скоростью более 11 000 об/мин (12 000 × g) в течение 10–15 минут, осторожно перенесите супернатант в новую центрифужную пробирку с круглым дном емкостью 50 мл (приготовленную самостоятельно) и избегайтеаспирируйте плавающий белый осадок.

Δ Добавьте буфер P4 и сразу же переверните, чтобы хорошо перемешать.Оставьте пробирку стоять до тех пор, пока белый осадок не распределится равномерно по раствору, чтобы предотвратить образование локальных осадков, которые могут повлиять на нейтрализацию.Если перед центрифугированием не образуется однородный белый хлопьевидный осадок, а после центрифугирования супернатант не становится прозрачным, пробирку можноцентрифугировали еще 5 мин.

5. Добавьте 0,1-кратный объем (10% объема надосадочной жидкости, около 2,2 мл) Endotoxin Scavenger к надосадочной жидкости, полученной на этапе 4, и переверните, чтобы перемешать.Поместите раствор в ледяную баню или в колотый лед (или в холодильник с морозильной камерой) на 5 минут, пока раствор не изменится с мутного на прозрачный и прозрачный (или станет неподвижным).слегка мутный) и периодически перемешивайте несколько раз.

Δ После добавления к супернатанту поглотителя эндотоксинов супернатант станет мутным, ноНадосадочная жидкость должна стать прозрачной (или слегка мутной) после охлаждения на ледяной бане.

6. После того, как надосадочную жидкость поместят при комнатной температуре (>25℃) на 10–15 минут, она станет мутной, какего температура повышается до комнатной.Затем надосадочную жидкость следует перевернуть для перемешивания.

Δ Если комнатная температура ниже или вы хотите сократить время экстракции, надосадочную жидкость можно инкубировать на водяной бане при температуре 37 ~ 42 ℃ в течение 5–10 минут, а следующий этап можно выполнить после супернатанта.становится мутным.

7. Центрифугируйте надосадочную жидкость при скорости около 11 000 об/мин (12 000 × g) в течение 10 минут при комнатной температуре (температура должна быть >25 ℃) для разделения фаз.Верхняя водная фаза содержит ДНК, а нижний слой синей маслянистой фазы содержит эндотоксин и другие примеси.ПеренеситеВодную фазу, содержащую ДНК, в новую пробирку иотбросьте маслянистый слой.

Δ Температура во время центрифугирования должна быть выше 25 ℃, поскольку эффективное разделение фаз не происходит.происходит, если температура слишком низкая.

Δ Если разделение фаз неэффективно, температуру центрифугирования можно отрегулировать до 30 ℃ ивремя центрифугирования можно увеличить до 15 мин.

Δ Не высасывайте синий маслянистый слой, так как он содержит эндотоксин и другие примеси.

Механизм

Ресуспендирование Лизис Нейтрализация

◇ Добавьте 7,5 мл буфера P1.

◇ Добавьте 7,5 мл буфера P2.

◇ Добавьте 7,5 мл буфера P4.

Удаление эндотоксина

◇Добавьте 0,1-кратный объем надосадочной жидкости Endotoxin Scavenger.

Переплет и стирка

◇ Добавьте 0,5-кратный объем изопропанола.

◇ Добавьте 10 мл буфера PW.