Обратная транскриптаза M-MLV
Обратная транскриптаза RevScript получена методом генной инженерии.Он обладает более высокой способностью к синтезу кДНК, термической стабильностью и температурным пределом реакции (до 60°С).Синтезированный продукт кДНК имеет размер до 10 т.п.н.Он повышает аффинность матриц и подходит для обратной транскрипции РНК-матриц со сложной вторичной структурой или малокопийными генами.
Компоненты
| Компонент | HC2003Б (10 000 ЕД) | HC2003Б (5*10 000 ЕД) | HC2003Б (200 000 ЕД) |
| Обратная транскриптаза RevScript (200 ЕД/мкл) | 50 мкл | 5×50 мкл | 1 мл |
| 5 × буфер RevScript | 250 мкл | 1,25 мл | 5 мл |
Условия хранения
Этот продукт следует хранить при температуре -25°C~-15°C в течение 2 лет.
Определение единицы измерения
Одна единица включает 1 нмоль dTTP в нерастворимый в кислоте материал за 10 минут при 37°C с использованием Oligo(dT) в качестве праймера.
Настройка реакции
1.Денатурация матрицы РНК (этот шаг не является обязательным, денатурация матрицы РНК помогает открыть вторичные структуры, что улучшит выход первой цепи кДНК.)
| Компоненты | Объем (мкл) |
| DDH без РНКазы2O | до 13 |
| Олиго(дТ)18 (50 мкмоль/л) или случайный праймер (50 мкмоль/л) Или ген-специфические праймеры (2 мкмоль/л) | 1 |
| или 1 | |
| или 1 | |
| шаблон РНК | X a |
Примечания:
1) а: Общая РНК: 1–5 мкг или мРНК: 1–500 нг
2) Инкубирование при 65°C в течение 5 минут, затем немедленно перенос на лед для охлаждения на 2 минуты.Кратковременно центрифугируйте для сбора реакционной жидкости, добавьте раствор реакции обратной транскрипции, как показано в следующей таблице.Аккуратно перемешайте пипеткой.
1.Приготовление реакционной смеси (объем 20 мкл)
| Компоненты | Объем (мкл) |
| Смесь предыдущего шага | 13 |
| 5×Буфер | 4 |
| Смесь дНТФ (10 нмоль/л) | 1 |
| Обратная транскриптаза (200 ЕД/мкл) | 1 |
| Ингибитор РНКазы (40 ЕД/мкл) | 1 |
1.Реакцию проводят при следующих условиях:
| Температура (°С) | Время |
| 25 °Сa | 5 минут |
| 42 °Сb | 15-30 минут |
| 85 °Сc | 5 минут |
Примечания:
1) а.Инкубация при 25°C в течение 5 минут требуется только для использования случайных гексамеров.Пожалуйста, пропустите этот шаг при использовании Oligo (dT)18или ген-специфический праймер.
2) б.Рекомендуемая температура обратной транскрипции — 42°С. Для матриц со сложной вторичной структурой или высоким содержанием GC рекомендуется повысить температуру реакции до 50-55°С.
3) в.Нагревание при 85°C в течение 5 минут для инактивации обратной транскриптазы.
4) Продукт можно использовать непосредственно в реакциях ПЦР или кПЦР или хранить при температуре -20°C для кратковременного хранения.Для длительного хранения рекомендуется разделить продукцию и хранить при температуре -80°С.Избегайте частого замораживания-оттаивания.
5) Продукт подходит для одноэтапной RT-qPCR, рекомендуется добавлять 10-20 единиц обратной транскриптазы на каждые 25 мкл реакционной системы или постепенно увеличивать количество обратной транскриптазы в зависимости от реальной ситуации.
Примечания
1.Пожалуйста, держите экспериментальную зону в чистоте;Во время работы следует надевать чистые перчатки и маски.Все расходные материалы, используемые в эксперименте, не должны содержать РНКазы, чтобы предотвратить загрязнение РНКазой.
2.Все процедуры следует выполнять на льду, чтобы предотвратить деградацию РНК.
3.Для обеспечения высокой эффективности обратной транскрипции рекомендуется использовать образцы РНК высокого качества.
4.Этот продукт предназначен только для исследовательского использования.
5.Для вашей безопасности работайте в лабораторных халатах и одноразовых перчатках.
