Урацил ДНК-гликозилаза
Урацил-ДНК-гликозилаза (УНГ или УДГ) представляет собой рекомбинантный клон E.coli с молекулярной массой 25 кДа.Он катализирует высвобождение свободного урацила из урацилсодержащей одноцепочечной и двухцепочечной ДНК, неактивен в отношении РНК и может использоваться для предотвращения загрязнения продуктов ПЦР-амплификации.Принцип действия основан на том, что при замене dUTP на dTTP в реакции ПЦР и образовании продукта ПЦР-амплификации, содержащего основания dU, фермент способен избирательно разрывать гликозидную связь оснований U в одноцепочечных и двухцепочечных основаниях. ДНК и разлагают продукт ПЦР-амплификации.
Рекомендуемое применение
Усиление предотвращения загрязнения
Условия хранения
-20°C для длительного хранения, перед использованием следует тщательно перемешать, избегать частого замораживания-оттаивания.
Буфер хранения
20 мМ трис-HCl (pH 8,0), 150 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА, 1 мМ ДТТ, стабилизатор, 50% глицерин.
Определение единицы измерения
Количество фермента, необходимое для расщепления 1 мкг одноцепочечной ДНК, содержащей основания dU, за 1 час при 37°C, составляет 1 единицу.
Контроль качества
1.Электрофоретическая чистота SDS-PAGE более 98%.
2.Чувствительность усиления, контроль от партии к партии, стабильность
3.После обработки 1U UNG при температуре 50℃ в течение 2 минут матрица, содержащая U менее 103 копий, должна полностью разложиться и продукт амплификации не может быть получен.
4.Отсутствие экзогенной нуклеазной активности
инструкции
| Компоненты | Объем (мкл) | Конечная концентрация |
| 10 × ПЦР-буфер (без dNTP, Mg²+бесплатно) | 5 | 1× |
| дУТФ (дЦТФ, дГТФ, дАТФ) | - | 200 мкм |
| dUTP (заменить dTTP) | - | 200-600 мкм |
| 25 мМ MgCl2 | 2–8 мкл | 1-4 мм |
| 5 ед./мкл Taq | 0,25 | 1,25 ЕД |
| 5 Ед/мкл УНГ | 0,25 (0,1-0,5) | 0,25 ЕД (0,1-0,5) |
| 25 × Праймер-микса | 2 | 1× |
| Шаблон | - | <1 мкг/реакция |
| ddH₂O | до 50 | - |
Примечание: а: При использовании для qPCR/qRT-PCR флуоресцентный зонд следует добавить в реакционную систему.Обычно конечная концентрация праймера 0,2 мкМ может дать хорошие результаты;когда эффективность реакции плохая, концентрацию праймера можно регулировать в диапазоне 0,2-1 мкМ.Обычно концентрация зонда оптимизируется в диапазоне 0,1-0,3 мкМ.Можно провести эксперименты с градиентом концентрации, чтобы найти наилучшую комбинацию праймера и зонда.
Примечания
1.Фермент UNG можно использовать для удаления загрязненных продуктов амплификации dUTP из реакционной системы перед реакцией ПЦР-амплификации, чтобы затем избежать ложноположительных результатов из-за загрязнения продукта.
2.Оптимальная температура для фермента UNG, используемого в реакции ПЦР против загрязнения, обычно составляет 50 ℃ в течение 2 минут;условие инактивации составляет 95 ℃ в течение 5 минут.
3.Избегайте частого замораживания и оттаивания и не подвергайте большим колебаниям температуры.
4.Разные гены, подлежащие амплификации, имеют разную эффективность использования dUTP и чувствительность к ферменту UNG, поэтому, если использование системы UNG приводит к снижению чувствительности обнаружения, реакционную систему следует настроить и оптимизировать. Если вам нужна техническая поддержка, обращайтесь Наша компания.
