Протеиназа К (жидкость)
Кат. номер: HC4502A
Протеиназа К представляет собой стабильную сериновую протеазу с широкой субстратной специфичностью.Он разрушает многие белки в нативном состоянии даже в присутствии детергентов.Данные исследований кристаллической и молекулярной структуры показывают, что фермент принадлежит к семейству субтилизинов с каталитической триадой активного центра (Asp39-Его69- Сер224).Преимущественным местом расщепления является пептидная связь, примыкающая к карбоксильной группе алифатических и ароматических аминокислот с заблокированными альфа-аминогруппами.Он обычно используется из-за его широкогоспецифичность.
Спецификация
| Появление | Бесцветная или светло-коричневая жидкость |
| Активность | ≥800 Ед/мл |
| Концентрация белка | ≥20 мг/мл |
| ДНКаза | Ничего не обнаружено |
| РНКаза | Ничего не обнаружено |
Условия хранения
Хранить при температуре 2-8℃.
Характеристики
| Номер ЕС | 3.4.21.64 (рэкомбинант из альбома Tritirachium) |
| Молекулярная масса | 29 кДа (SDS-ПААГ) |
| Изоэлектрическая точка | 7,81 |
| Оптимальный pH | 7,0-12,0 Рис.1 |
| Оптимальная температура | 65 ℃ Рис.2 |
| стабильность pH | pH 4,5-12,5 (25℃, 16 ч) Рис.3 |
| Термическая стабильность | Ниже 50℃ (pH 8,0, 30 минут) Рис.4 |
| Активаторы | ДСН, мочевина |
| Ингибиторы | Диизопропилфторфосфат;фенилметилсульфонилфторид |
Приложения
1. Генетический диагностический набор.
2. Наборы для экстракции РНК и ДНК.
3. Экстракция небелковых компонентов из тканей, деградация белковых примесей, например ДНК-вакцин и получение гепарина.
4. Подготовка хромосомной ДНК импульсным электрофорезом.
5. Вестерн-блоттинг
6. Реагенты ферментативного гликозилированного альбумина для диагностики in vitro.
Меры предосторожности
При использовании или взвешивании надевайте защитные перчатки и очки и обеспечивайте хорошую вентиляцию после использования.Этот продукт может вызвать кожную аллергическую реакцию и серьезное раздражение глаз.При вдыхании он может вызвать симптомы аллергии, астмы или одышку.Может вызвать раздражение дыхательных путей.
анализ
Определение единицы измерения
Одна единица (Е) определяется как количество фермента, необходимое для гидролиза казеина с получением 1 мкмоль тирозина в минуту при следующих условиях.
Подготовка реагентов
Реагент I: 1 г молочного казеина растворяли в 50 мл 0,1 М раствора фосфата натрия (рН 8,0), инкубировали в воде при температуре 65–70 ℃ в течение 15 минут, перемешивали и растворяли, охлаждали водой, доводили гидроксидом натрия до рН 8,0 и фиксировали. объем 100мл.
Реагент II: раствор ТСА: 0,1 М трихлоруксусная кислота, 0,2 М ацетат натрия, 0,3 М уксусная кислота.
Реагент III: 0,4 М Na.2CO3решение.
Реагент IV: Реагент Форинт, разбавленный чистой водой в 5 раз.
Реагент V: Разбавитель фермента: 0,1 М раствор фосфата натрия (рН 8,0).
Реагент VI: раствор тирозина: 0, 0,005, 0,025, 0,05, 0,075, 0,1, 0,25 мкмоль/мл тирозина, растворенного в 0,2 М HCl.
Процедура
1. 0,5 мл реагента I предварительно нагревают до 37 ℃, добавляют 0,5 мл раствора фермента, хорошо перемешивают и инкубируют при 37 ℃ в течение 10 минут.
2. Добавьте 1 мл реагента II, чтобы остановить реакцию, хорошо перемешайте и продолжайте инкубацию в течение 30 минут.
3. Центрифугируйте реакционный раствор.
4. Возьмите 0,5 мл супернатанта, добавьте 2,5 мл реагента III, 0,5 мл реагента IV, хорошо перемешайте и инкубируйте при 37 ℃ в течение 30 минут.
5. ОД660определялось как ОД1;пустая контрольная группа: 0,5 мл реагента V используется для замены раствора фермента для определения OD.660как ОД2, ΔOD=OD1-ОД2.
6. Стандартная кривая L-тирозина: 0,5 мл раствора L-тирозина различной концентрации, 2,5 мл реагента III, 0,5 мл реагента IV в центрифужной пробирке объемом 5 мл, инкубировать при 37 ℃ в течение 30 минут, определить ОП.660для разных концентраций L-тирозина затем получили стандартную кривую Y=kX+b, где Y - концентрация L-тирозина, X - OD600.
Расчет
2: Общий объем реакционного раствора (мл).
0,5: Объем раствора фермента (мл).
0,5: Объем реакционной жидкости, использованный при хромогенном определении (мл).
10: Время реакции (мин)
Df: Многократное разбавление
C: Концентрация фермента (мг/мл)
Рекомендации
1. Вигер У и Хильц Х. FEBS Lett.(1972);23:77.
2. Вигер У и Хильц Х. Биохимия.Биофиз.Рез.Коммун.(1971);44:513.
3. Хильц, Х.и другие.,Евро.Дж. Биохим.(1975);56:103–108.
4. Сэмбрук Дж.et ал., Молекулярное клонирование: Лабораторное руководство, 2-е издание, Лабораторное издательство Колд-Спринг-Харбор, Колд-Спринг-Харбор (1989).
Цифры
инжир. 1 Оптимум pH
100 мМ буферный раствор: pH 6,0-8,0, Na-фосфат;pH 8,0-9,0, Трис-HCl;pH 9,0–12,5, глицин-NaOH. Концентрация фермента: 1 мг/мл.
Рис. 2 Оптимальная температура
Реакция в 20 мМ К-фосфатном буфере, pH 8,0.Концентрация фермента: 1 мг/мл
Рис. 3 pH Стабильность
25℃, обработка 16 ч 50 мМ буферным раствором: pH 4,5-5,5, ацетат;pH 6,0-8,0, Na-фосфат;pH 8,0-9,0, Трис-HCl.pH 9,0-12,5, Глицин-NaOH.Концентрация фермента: 1 мг/мл
Рис. 4 Термический стабильность
30-минутная обработка 50 мМ трис-HCl-буфером, pH 8,0.Концентрация фермента: 1 мг/мл
Рис. 5 Хранение стабильныйty at 25℃
