Обратная транскриптаза M-MLV Neoscript
Обратная транскриптаза Neoscript представляет собой обратную транскриптазу, полученную путем скрининга мутаций гена M-MLV вируса мышиного лейкоза Молони, происхождения и экспрессии в E.coli.Фермент удаляет активность РНКазы H, обладает более высокой температурной устойчивостью и пригоден для высокотемпературной обратной транскрипции.Следовательно, он полезен для устранения неблагоприятного воздействия структуры высокого уровня РНК и неспецифических факторов на синтез кДНК, а также обладает более высокой стабильностью и способностью к синтезу обратной транскрипции.Фермент обладает более высокой стабильностью и способностью к синтезу обратной транскрипции.
Компоненты
1.200 ЕД/мкл обратной транскриптазы Neoscript
2.5 × буфер первой цепи (опционально)
* 5 × буфер первой цепи не содержит дНТФ, пожалуйста, добавьте дНТФ при подготовке реакционной системы
Рекомендуемое применение
1.Одноэтапная qRT-PCR.
2.Обнаружение РНК-вируса.
Условия хранения
-20°C для длительного хранения, перед использованием следует тщательно перемешать, избегать частого замораживания-оттаивания.
Определение единицы измерения
Одна единица включает 1 нмоль dTTP за 10 минут при 37°C с использованием поли(А)•олиго(дТ).25в качестве шаблона/праймера.
Контроль качества
1.Электрофоретическая чистота SDS-PAGE более 98%.
2.Чувствительность усиления, контроль от партии к партии, стабильность.
3.Нет экзогенной нуклеазной активности, нет экзогенной эндонуклеазы или загрязнения экзонуклеазой.
Настройка реакции для первого решения цепной реакции
1.Приготовление реакционной смеси
| Компоненты | Объем |
| Олиго(дТ)12-18 Праймер или Случайный праймера Или праймеры, специфичные для геновb | 50 пмоль |
| 50 пмоль (20-100 пмоль) | |
| 2 пмоль | |
| 10 мМ дНТФ | 1 мкл |
| Шаблонная РНК | Общая РНК≤ 5 мкг;мРНК≤ 1 мкг |
| dH без РНКазы2O | До 10 мкл |
Примечания:a/b: Пожалуйста, выберите различные типы праймеров в соответствии с вашими экспериментальными потребностями.
2.Нагрейте при 65°C в течение 5 минут и быстро охладите на льду в течение 2 минут.
3.Добавьте следующие компоненты в вышеуказанную систему до общего объема 20 мкл и осторожно перемешайте:
| Компоненты | Объем (мкл) |
| 5 × буфер первой цепи | 4 |
| Обратная транскриптаза Neoscript (200 ЕД/мкл) | 1 |
| Ингибитор РНКазы (40 ЕД/мкл) | 1 |
| dH без РНКазы2O | До 20 мкл |
4. Пожалуйста, проведите реакцию в соответствии со следующими условиями:
(1) Если используется случайный праймер, реакцию следует проводить при 25 ℃ в течение 10 минут, а затем при 50 ℃ в течение 30–60 минут;
(2) Если используются Oligo dT или специальные праймеры, реакцию следует проводить при 50 ℃ в течение 30–60 минут.
5.Нагрейте при 95 ℃ в течение 5 минут, чтобы инактивировать обратную транскриптазу Neoscript и остановить реакцию.
6.Продукты обратной транскрипции можно использовать непосредственно в реакции ПЦР и количественной реакции флуоресценции ПЦР или хранить при -20 ℃ в течение длительного времени.
ПЦР Рдействие:
1.Приготовление реакционной смеси
| Компоненты | Концентрация |
| 10 × ПЦР-буфер (без dNTP, без Mg²+) | 1× |
| дНТФ (по 10 мМ каждый дНТФ) | 200 мкм |
| 25 мМ MgCl2 | 1-4 мм |
| ДНК-полимераза Taq (5 ед./мкл) | 2-2,5 ЕД |
| Праймер 1 (10 мкМ) | 0,2-1 мкм |
| Праймер 2 (10 мкМ) | 0,2-1 мкм |
| Шаблона | ≤10 % раствор для первой цепной реакции (2 мкл) |
| ддх2O | До 50 мкл |
Примечания:а: Если добавить слишком много раствора первой цепной реакции, реакция ПЦР может быть ингибирована.
2.Процедура ПЦР-реакции
| Шаг | Температура | Время | Циклы |
| Предварительная денатурация | 95℃ | 2-5 минут | 1 |
| Денатурация | 95℃ | 10-20 секунд | 30-40 |
| Отжиг | 50-60℃ | 10-30 сек. | |
| Расширение | 72℃ | 10-60 сек. |
Примечания
1.Подходит для оптимизации температуры обратной транскрипции в диапазоне 42 ℃ ~ 55 ℃.
2.Он имеет лучшую стабильность, подходит для высокотемпературной амплификации обратной транскрипции.Кроме того, он благоприятен для эффективного прохождения через сложные структурные участки РНК.Кроме того, этоподходит для одноэтапного мультиплексного флуоресцентного количественного обнаружения RT-PCR.
3.Хорошая совместимость с различными ферментами ПЦР-амплификации и подходит для высокочувствительных реакций ОТ-ПЦР.
4.Подходит для высокочувствительной одноэтапной флуоресцентной количественной реакции RT-PCR, эффективно повышает скорость обнаружения низкой концентрации шаблонов.
5.Подходит для создания библиотеки кДНК.
