ДНК-полимераза Hotstart Taq
ДНК-полимераза Hot Start Taq (модификация антитела) представляет собой термостабильную ДНК-полимеразу горячего старта из Thermus aquaticus YT-1, которая обладает 5'→3'-полимеразной активностью и эндонуклеазной активностью 5'-клапана.ДНК-полимераза Taq с горячим стартом представляет собой ДНК-полимеразу Taq, модифицированную термолабильными антителами Taq.Модификация антител повысила специфичность, чувствительность и выход ПЦР.
Компоненты
| Компонент | HC1012А-01 | HC1012А-02 | HC1012А-03 | HC1012А-04 |
| 5×HC Taq-буфер | 4×1 мл | 4×10 мл | 4×50 мл | 5×400 мл |
| ДНК-полимераза Hot Start Taq (модифицированная антителами) (5 ЕД/мкл) | 0,1 мл | 1 мл | 5 мл | 10×5 мл |
Приложения
10 мм трис-HCl (pH 7,4 при 25 ℃), 100 мм KCl, 0,1 мм ЭДТА, 1 мм дитиотреитол, 0,5% Твин20, 0,5% IGEPALCA-630 и 50% глицерин.
Условия хранения
Транспортировать при температуре 0°C и хранить при температуре -25°C~-15°C.
Определение единицы измерения
Одна единица определяется как количество фермента, которое включает 15 нмоль dNTP в нерастворимый в кислоте материал за 30 минут при 75°C.
Контроль качества
1.Endонуклеазная активность:Инкубация 20 ЕД фермента с 4 мкг ДНК pUC19 в течение 4 часов при 37 ℃ не привела к заметному разрушению ДНК, что определялось с помощью гель-электрофореза.
2.5 кб Лямбда-ПЦР:25 циклов ПЦР-амплификации 5 нг лямбда-ДНК с 1,25 единиц Taq ДНК-полимеразы в присутствии 200 мкМ dNTP и 0,2 мкМ праймеров приводят к получению ожидаемого продукта размером 5 т.п.н.
3.Экзонуклеазная активность:Инкубация 50 мкл реакционной смеси, содержащей минимум 12,5 ед. ДНК-полимеразы Taq, с 10 нмоль 5´-FAM олигонуклеотида в течение 30 минут при 37 ℃ не приводит к заметному разложению.
4.РНКазная активность:Инкубация 10 мкл реакционной смеси, содержащей 20 ЕД фермента, с 1 мкг транскриптов РНК в течение 2 часов при 37°C не приводила к заметному разрушению РНК, что определялось с помощью гель-электрофореза.
5.Тепловая инактивация:Нет.
Реакционная система
| Компоненты | Объем |
| ДНК шаблонаa | необязательный |
| 10 мкМ Форвард Праймер | 0,5 мкл |
| 10 мкМ обратный праймер | 0,5 мкл |
| Смесь дНТФ (по 10 мМ каждый) | 0,5 мкл |
| 5×HC Taq-буфер | 5 мкл |
| ДНК-полимераза Taqб(5Ед/мкл) | 0,125 мкл |
| Безнуклеазная вода | До 25 мкл |
Примечания:
1) а.
| ДНК | Количество |
| геномный | 1 нг-1 мкг |
| Плазмида или вирус | 1 пг-1 нг |
2) б.Оптимальная концентрация ДНК-полимеразы Taq может находиться в диапазоне 5–50 единиц/мл (0,1–0,5 единиц/25 мкл реакции) в специализированных приложениях.
Протокол термоциклирования
ПЦР
| Шаг | Температура(°С) | Время | Циклы |
| Начальная денатурацияa | 95 ℃ | 1-3 минуты | - |
| Денатурация | 95 ℃ | 15-30 с | 30-35 циклов |
| Отжигб | 45-68 ℃ | 15-60 с | |
| Расширение | 68 ℃ | 1кб/мин | |
| Окончательное продление | 68 ℃ | 5 минут | - |
Примечания:
1) Начальная денатурация в течение 1 минуты при 95°C достаточна для большинства амплификаций.Для сложных шаблонов рекомендуется более длительная денатурация в течение 2–3 минут при температуре 95°C.При ПЦР колоний рекомендуется первоначальная 5-минутная денатурация при 95°C.
2) Стадия отжига обычно составляет 15-60 с.Температура отжига зависит от Tm пары праймеров и обычно составляет 45–68 ℃.
