Мини-набор для экстракции ДНК
В этом наборе используется оптимизированная буферная система и технология очистки на колонке с силикагелем, которая позволяет восстанавливать фрагменты ДНК размером 70 п.о. – 20 т.п.н. из различных концентраций агарозного геля TAE или TBE.Колонка адсорбции ДНК может специально адсорбировать ДНК в условиях высокого содержания соли.Кроме того, набор может непосредственно очищать фрагменты ДНК от продуктов ПЦР, ферментативных реакционных систем или сырых продуктов ДНК, полученных другими методами, а также удалять примеси, такие как белки, другие органические соединения, ионы неорганических солей и олигонуклеотидные праймеры.Это может гарантировать, что очистка может быть завершена в течение 10-15 минут.Очищенную ДНК можно использовать непосредственно для лигирования, трансформации, ферментативного расщепления, транскрипции in vitro, ПЦР, секвенирования, микроинъекций и т. д.
Условия хранения
Хранить при температуре -15 ~ -25℃ и транспортировать при комнатной температуре.
Компоненты
| Компоненты | (100 запросов) |
| Буферный ВВП | 80 мл |
| Буфер ГВ | 2 × 20 мл |
| Элюирующий буфер | 20 мл |
| Мини-колонки FastPure DNA-G | 100 |
Буферный ВВП:ДНК-связывающий буфер.
Буфер ГВ:Промывной буфер;Перед использованием добавьте абсолютный этанол в указанном на флаконе объеме.
Элюирующий буфер:Элюирование.
Мини-колонки FastPure DNA-G:Колонки для адсорбции ДНК.
Пробирки для сбора 2 мл:Трубки для сбора фильтрата.
Подготовленные материалы
Пробирки стерилизованные по 1,5 мл, абсолютный этанол и изопропанол (при фрагменте ДНК ≤100 п.о. добавить 1 объем
изопропанол на 1 объем геля), водяная баня.
Процесс эксперимента
Перед использованием добавьте 80 мл этанола для разбавления буфера GW, как указано на этикетке, храните при комнатной температуре.
Механизм
1. Реакционный раствор ПЦР
Схема экстракции геля: Добавьте равный объем буфера GDP для реакции ПЦР. Схема восстановления раствора:Добавьте в 5 раз больший объем буфера
2. ВВП Рассчитайте объём геля(100 μл равен 100 мг)
Растворить гель
3. Разогрейте при 50 ~ 55℃
4. Связать мытье
Добавьте 300 мкл буфера GDP*
Добавьте 700 мкл буфера GW.
Добавьте 700 мкл буфера GW.
5. Элюировать
Добавьте 20–30 мкл элюирующего буфера или деионизированной воды.
Примечания* Восстановление реакционной жидкости ПЦР без этого этапа
Программа экстракции геля
1. После электрофореза ДНК для фракционирования фрагментов ДНК вырезают одну полоску фрагмента ДНК из агарозного геля под УФ-светом.Рекомендуется использовать впитывающую бумагу, чтобы поглотить видимую влагу геля и минимизировать размер кусочка геля, удаляя, насколько это возможно, лишнюю агарозу.Взвесьте срез геля (без микроцентрифужной пробирки), чтобы рассчитать его объем: объем среза геля 100 мг составляет примерно 100 мкл, при условии, что плотность равна 1 г/мл.
2. Добавьте равный объем буфера GDP, инкубируйте при температуре 50–55 ℃ в течение 7–10 минут (в зависимости от размера геля, отрегулируйте время инкубации до полного растворения геля).Во время инкубации переверните пробирку 2 раза.
Δ Добавление 1-3 объемов Buffer GDP не повлияет на эффективность восстановления ДНК.Если фрагмент ДНК, который необходимо восстановить, <100 п.н., необходимо добавить 3 объема буфера GDP;когда кусочек геля полностью растворится, добавьте 1 объем изопропанола и тщательно перемешайте, затем переходите к следующему шагу.
3. Ненадолго центрифугируйте, чтобы образец оказался на дне пробирки, вставьте мини-колонки FastPure DNA-G в пробирки для сбора проб емкостью 2 мл, осторожно перенесите раствор (максимум 700 мкл один раз в день).
время фильтрования колонны центрифугируют при 12000 об/мин (13800 X g) в течение 30-60 сек.
4. Отбросьте фильтрат и добавьте в колонку 300 мкл буфера GDP, инкубируйте при комнатной температуре в течение 1 минуты, центрифугируйте при 12 000 об/мин (13 800 g) в течение 30–60 секунд.
5. Отбросьте фильтрат и добавьте в колонку 700 мкл буфера GW (заранее проверьте, был ли добавлен абсолютный этанол!) в колонку, центрифугируйте при 12 000 об/мин (13 800 g) в течение 30–60 с.
Δ Добавьте Buffer GW вокруг стенок адсорбционной колонки или добавьте заднюю крышку Buffer GW и перемешайте его в перевернутом состоянии 2–3 раза, чтобы полностью смыть соль, прилипшую к стенкам трубки.
6. Повторите шаг 5.
Δ Двукратная промывка буфером GW может гарантировать полное удаление соли и исключить влияние на последующие эксперименты.
7. Отбросьте фильтрат и центрифугируйте пустую колонку при 12 000 об/мин (13 800 g) в течение 2 минут.
8. Вставьте колонку в чистую микроцентрифужную пробирку емкостью 1,5 мл, добавьте 20–30 мкл элюирующего буфера в центр мембраны колонки, инкубируйте в течение 2 минут, а затем центрифугируйте при 12 000 об/мин (13 800 g) в течение 1 минуты.Колонку выбросьте, полученную ДНК храните при -20°С.
Δ Перенос супернатанта, полученного на этапе 8, в колонку для повторного элюирования и предварительный нагрев элюирующего буфера до 55°С (когда фрагмент ДНК >3 т.п.н.) может оказаться полезным для повышения эффективности восстановления.
Программа восстановления ПЦР-продуктов
Этот протокол применим для очистки фрагментов ДНК от продуктов ПЦР, ферментативной реакционной системы и других сырых продуктов ДНК (включая генетическую ДНК).Этот раствор может эффективно удалять различные нуклеотиды, праймеры, димеры праймеров, молекулы солей, ферменты и другие примеси.
1. Кратковременно центрифугируйте продукты ПЦР, раствор ферментативной реакции и другие неочищенные продукты ДНК.Оцените их объем пипеткой и перенесите в стерилизованную пробирку емкостью 1,5 или 2 мл.Добавляйте ddH2O до достижения объема 100 мкл;в то время как для геномной ДНК с высокой концентрацией разбавление до 300 мкл ddH2O поможет повысить эффективность восстановления.
2. Добавьте 5 объемов Buffer GDP, тщательно перемешайте, переворачивая или встряхивая.Если интересующий фрагмент ДНК> 100 п.н., необходимо добавить дополнительные 1,5 объема (образцы + ВВП буфера) этанола.
3. Вставьте колонку обратно в пробирку для сбора, перенесите смесь в колонку, центрифугируйте при 12 000 об/мин (13 800 ×g) в течение 30–60 с.Если объем смешанного раствора >700 мкл, поместите адсорбционную колонку обратно в пробирку для сбора, остаток раствора перенесите в адсорбционную колонку и центрифугируйте при 12 000 об/мин (13 800 × g) в течение 30–60 с.
4. Следующее действие относится к шагам 5–8 программы 08-1/Экстракция геля.
Приложения
Различные концентрации агарозного геля ТАЕ или ТВЕ;Продукты ПЦР, ферментативные реакционные системы или другие продукты сырой ДНК, полученные различными методами.Найденные фрагменты варьировались от70 п.н. -20 кб.
Примечания
Только для исследовательского использования.Не для использования в диагностических процедурах.
1. Перед использованием добавьте 80 мл этанола в разбавленный буфер GW, как указано на этикетке, храните при комнатной температуре.
2. Если буфер GDP легко осаждается при хранении при низкой температуре, перед использованием его можно поместить на некоторое время при комнатной температуре.При необходимости его можно предварительно нагреть на водяной бане с температурой 37℃ до полного растворения осадка, а затем после смешивания его можно использовать.
3. Заранее установите температуру водяной бани на 50–55 ℃.
4. На этапе 1 программы экстракции геля 08-1/Gel минимизация размера среза геля значительно сократит время растворения и повысит эффективность восстановления (линеаризованная ДНК легко гидролизуется при постоянном воздействии высокой температуры).Не подвергайте ДНК-гель воздействию ультрафиолета в течение длительного времени, так как ультрафиолет может вызвать повреждение ДНК.
5. Полностью растворите гель в шаге 2 программы экстракции 08-1/Gel, в противном случае эффективность восстановления ДНК будет серьезно снижена.
6. Предварительно нагрейте элюционный буфер или ddH2O до 55 ℃, что поможет повысить эффективность элюирования ДНК.ДНК рекомендуется хранить в элюенте 2,5 мМ Трис-HCl, pH 7,0–8,5.
