5×премикс Neoscript Fast RT-qPCR плюс-UNG
Кат. номер: HCB5142A
Neoscript Fast RT Premix-UNG (зонд qRT-PCR) представляет собой высокостабильную смесь на основе зондов в одной пробирке, подходящую для одноэтапной обратной транскрипции и количественной ПЦР (qRT-PCR).Он поддерживает предварительное смешивание праймеров и зондов и остается стабильным после длительного хранения при низкой температуре.Тестируемый образец можно добавлять непосредственно во время использования, без дополнительных операций по открытию пробирки/пипетированию.В состав этого продукта входят такие компоненты, как ДНК-полимераза горячего старта, M-MLV, термолабильная урацил-ДНК-гликозилаза (TS-UNG), ингибитор РНКазы, MgCl.2, dNTP (с dUTP вместо dTTP) и стабилизаторы.С помощью генетически модифицированной обратной транскриптазы быстрой амплификации и ДНК-полимеразы можно завершить ПЦР-амплификацию в течение 20-40 минут.В этом реагенте используется специальный буфер для кПЦР со смешанными ферментами антиингибирующего фермента амплификации и фермента УНГ.Таким образом, он может получить хорошую амплификацию целевых генов и предотвратить ложную амплификацию, вызванную остаточным ПЦР и аэрозольным загрязнением.Этот реагент совместим с большинством приборов для флуоресцентной количественной ПЦР таких производителей, как Applied Biosystems, Eppendorf, Bio-Rad и Roche.
Компонент
1.25 × смесь Neoscript Fast RTase/UNG
2.5×премикс-буфер Neoscript Fast RT (dUTP)
Условия хранения
Все компоненты следует хранить при температуре -20℃ при длительном хранении и при температуре 4℃ до 3 месяцев.Пожалуйста, тщательно перемешайте после оттаивания и центрифугируйте перед использованием.Избегайте частого замораживания-оттаивания.
Подготовка реакционной системы qRT-PCR
| Компоненты | 25мклСистема | 50мклСистема | Окончательная концентрация |
| 5×премикс-буфер Neoscript Fast RT (dUTP) | 5 мкл | 10 мкл | 1× |
| 25 × смесь Neoscript Fast RTase/UNG | 1 мкл | 2 мкл | 1× |
| 25×смесь праймер-зондa | 1 мкл | 2 мкл | 1× |
| Шаблонная РНКb | – | – | – |
| ддх2O | До 25 мкл | До 50 мкл | – |
1) а. Конечная концентрация праймера обычно составляет 0,2 мкм.Для достижения лучших результатов концентрацию праймера можно оптимизировать в диапазоне 0,2–1 мкм.Обычно концентрацию зонда можно оптимизировать в диапазоне 0,1–0,3 мкм.
2) б. При использовании быстрой процедуры ПЦР увеличение концентрации праймеров и зондов может привести к лучшим результатам амплификации, и их соотношение должно быть соответствующим образом оптимизировано.
3) Различные типы образцов содержат разные типы и содержание ингибитора, а также количество копий целевого гена.Объем выборки следует учитывать в зависимости от фактического состояния.При необходимости разведите образец водой, не содержащей нуклеаз, или буфером TE.
Реакция Сусловия
| Обычная процедура ПЦР | Быстрая процедура ПЦР | ||||||
| Процедура | Темп. | Время | Цикл | Процедура | Темп. | Время | Цикл |
| Обратная транскрипция | 50℃ | 10-20 минут | 1 | Обратная транскрипция | 50℃ | 5 минут | 1 |
| Полимераза Активация | 95℃ | 1-5 минут | 1 | Полимераза Активация | 95℃ | 30 лет | 1 |
| Денатурация | 95℃ | 10–20 секунд | 40-50 | Денатурация | 95℃ | 1-3 секунды | 40-50 |
| Отжиг и Расширение | 56-64℃ | 20-60-е годы | Отжиг и Расширение | 56-64℃ | 3–20 секунд | ||
Контроль качества
1.Функция обнаружения: чувствительность, специфичность и повторяемость qPCR.
2.Нет экзогенной нуклеазной активности: нет экзогенной эндонуклеазы и загрязнения экзонуклеазой.
Примечания
1.Скорость амплификации быстрой ДНК-полимеразы составляет не менее 1 кб/10 с.Различные инструменты для ПЦР имеют разные скорости нагрева и охлаждения, режимы контроля температуры и теплопроводность, поэтому оптимизация концентрации праймера/зонда и метода работы в сочетании с вашим конкретным инструментом для быстрой ПЦР имеет важное значение.
2.Этот продукт имеет широкую применимость и подходит для высокочувствительной молекулярной диагностики.Трехэтапный метод ПЦР рекомендуется для праймеров с низкой температурой отжига или для амплификации длинных фрагментов размером более 200 п.н.
3.Поскольку разные ампликоны имеют разную эффективность использования dUTP и разную чувствительность к UNG, реагенты следует оптимизировать, если чувствительность обнаружения снижается при использовании системы UNG.При необходимости свяжитесь с нами для получения технической поддержки.
4.Чтобы избежать амплификации остатков ПЦР-продуктов, для амплификации требуется выделенная экспериментальная зона и пипетка.Работайте в перчатках, часто меняйте их и не открывайте пробирку для ПЦР после амплификации.
