Фермент, блокирующий вирус осповакцины

Кэпирующий фермент вируса коровьей оспы получают из рекомбинантного штамма E. coli, несущего гены кэпирующего фермента осповакцины.Этот единственный фермент состоит из двух субъединиц (D1 и D12) и обладает тремя ферментативными активностями (РНК-трифосфатаза и гуанилилтрансфераза субъединицы D1 и гуанинметилтрансфераза субъединицы D12).Кэпирующий фермент вируса осповакцины эффективен для катализа образования кэп-структуры, которая может специфически прикреплять кэп-структуру 7-метилгуанилата (m7Gppp, Cap 0) к 5'-концу РНК.Структура кэпа (Cap 0) играет важную роль в стабилизации, транспорте и трансляции мРНК у эукариот.Кэпирование РНК с помощью ферментативной реакции — эффективный и простой метод, который может значительно улучшить стабильность и трансляцию РНК для транскрипции, трансфекции и микроинъекции in vitro.

Компоненты

Энзим, связывающий вирус осповакцины (10 ед/мкл)

10 × ограничивающий буфер

Условия хранения

-25～- 15℃ для хранения (Избегайте повторных циклов замораживания-оттаивания)

Буфер хранения

20 мМ Трис-HCl (pH 8,0), 100 мМ NaCl,

1 мМ ДТТ, 0, 1 мМ ЭДТА, 0, 1 % Тритон Х-100, 50 % глицерин.

Определение единицы измерения

Одна единица кэп-фермента вируса коровьей оспы определяется как количество фермента, необходимое для включения 10 пмоль GTP в транскрипт длиной 80 нуклеотидов за 1 час при 37°C.

Контроль качества

Экзонуклеаза:10 ед. кэп-фермента вируса коровьей оспы с 1 мкг ДНК, переваренной λ-Hind III, при 37 ℃ в течение 16 часов не приводят к разложению, что определяется электрофорезом в агарозном геле.

Эндонуклеаза:10 ЕД кэп-фермента вируса коровьей оспы с 1 мкг λДНК при 37 ℃ в течение 16 часов не приводят к разложению, что определяется электрофорезом в агарозном геле.

Никасе:10 ед. кэп-фермента вируса коровьей оспы с 1 мкг pBR322 при 37 ℃ в течение 16 часов не приводят к разложению, что определяется электрофорезом в агарозном геле.

РНКаза:10 ед. кэп-фермента вируса коровьей оспы с 1,6 мкг РНК MS2 в течение 4 часов при 37 ℃ не приводят к разложению, что определяется электрофорезом в агарозном геле.

1.ДНК кишечной палочки:10 ЕД кэп-фермента вируса коровьей оспы проверяют на наличие геномной ДНК E. coli с помощью TaqMan qPCR с праймерами, специфичными для локуса 16S рРНК E. coli.Загрязнение геномной ДНК E. coli составляет ≤1 генома E. coli.

2.Бактериальный Эндотоксин: LAL-тест, согласно Китайской Фармакопее IV, издание 2020 г., метод определения предела геля, общие правила (1143).Содержание бактериального эндотоксина должно быть ≤10 ЕЭ/мг.

Реакционная система и условия

1. Протокол кэппинга (объем реакции: 20 мкл)

Эта процедура применима к реакции кэпирования 10 мкг РНК (≥100 нт) и может быть масштабирована в соответствии с экспериментальными требованиями.

I) Объедините 10 мкг РНК и H2O, не содержащую нуклеазы, в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл до конечного объема 15,0 мкл.*10×Кэпирующий буфер: 0,5 М трис-HCl, 50 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ DTT, (25 ℃, pH 8,0)

2) Нагрейте при температуре 65 ℃ в течение 5 минут, а затем на ледяную баню в течение 5 минут.

3) Добавьте следующие компоненты в указанном порядке.

*10×Кэпирующий буфер: 0,5 М трис-HCl, 50 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ DTT, (25 ℃, pH 8,0).

4) Инкубируйте при 37°C в течение 30 минут. Теперь РНК закрыта и готова к дальнейшему использованию.

2. 5-футовый терминал реакция мечения (объем реакции: 20 мкл)

Этот протокол предназначен для маркировки РНК, содержащей 5'-трифосфат, и его можно масштабировать в соответствии с потребностями.На эффективность включения метки будет влиять молярное соотношение РНК: ГТФ, а также содержание ГТФ в образцах РНК.

1) Объедините необходимое количество РНК и H2O, не содержащего нуклеазы, в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл до конечного объема 14,0 мкл.

2) Нагрейте при температуре 65 ℃ в течение 5 минут, а затем на ледяную баню в течение 5 минут.

3) Добавьте следующие компоненты в указанном порядке.

** GTP MIX относится к GTP и небольшому количеству маркеров.Информацию о концентрации GTP см.к примечанию 3.

4) Инкубируйте при 37°C в течение 30 минут, теперь 5'-конец РНК помечен и готов к дальнейшему использованию.

Приложения

1. Кэпирование мРНК перед анализами трансляции/трансляцией in vitro

2. Маркировка 5'-конца мРНК

Примечания по использованию

1.Нагревание раствора РНК перед инкубацией с кэп-ферментом коровьей оспы удаляет вторичную структуру на 5'-конце транскрипта.Увеличьте время до 60 минут для транскриптов с известными высокоструктурированными 5'-концами.

2. РНК, используемая для реакций кэпирования, должна быть очищена перед использованием и суспендирована в воде, не содержащей нуклеаз.ЭДТА не должна присутствовать, а раствор не должен содержать солей.

3. Для мечения 5'-конца общая концентрация GTP должна примерно в 1-3 раза превышать молярную концентрацию мРНК в реакции.

4. Объем реакционной системы можно увеличивать или уменьшать в зависимости от фактического значения.