PNGase F
Пептид-N-гликозидаза F (PNGase F) является наиболее эффективным ферментативным методом удаления почти всех N-связанных олигосахаридов из гликопротеинов.PNGаза F представляет собой амидазу, которая расщепляет самые внутренние остатки GlcNAc и аспарагина в высокоманнозных, гибридных и сложных олигосахаридах из N-связанных гликопротеинов.
Приложение
Этот фермент полезен для удаления остатков углеводов из белков.
Подготовка и спецификация
| Появление | Бесцветная жидкость |
| Чистота белка | ≥95% (из SDS-PAGE) |
| Активность | ≥500 000 Ед/мл |
| Экзогликозидаза | Никакой активности не обнаружено (ND) |
| Эндогликозидаза F1 | ND |
| Эндогликозидаза F2 | ND |
| Эндогликозидаза F3 | ND |
| Эндогликозидаза H | ND |
| Протеаза | ND |
Характеристики
| Номер ЕС | 3.5.1.52(рекомбинант из микроорганизма) |
| Молекулярная масса | 35 кДа (SDS-ПААГ) |
| Изоэлектрическая точка | 8. 14 |
| Оптимальный pH | 7,0-8,0 |
| Оптимальная температура | 65 °С |
| Специфичность субстрата | Расщепление гликозидных связей между GlcNAc и остатками аспарагина Рис.1 |
| Сайты признания | N-связанные гликаны, если они не содержат фукозу α1-3 Рис. 2 |
| Активаторы | DTT |
| Ингибитор | Паспорт безопасности |
| Температура хранения | -25 ~-15 ℃ |
| Тепловая инактивация | Реакционную смесь объемом 20 мкл, содержащую 1 мкл PNGазы F, инактивируют инкубацией при 75 °C в течение 10 минут. |
Рис. 1. Субстратная специфичность PNGазы F.
Рис. 2. Результаты распознавания PNGase F.
Когда внутренние остатки GlcNAc связаны с фукозой α1-3, PNGаза F не может расщеплять N-связанные олигосахариды из гликопротеинов.Эта модификация распространена в гликопротеинах растений и некоторых насекомых.
Cкомпоненты
|
| Компоненты | Концентрация |
| 1 | PNGase F | 50 мкл |
| 2 | 10 × денатурирующий гликопротеин буфер | 1000 мкл |
| 3 | 10×гликобуфер 2 | 1000 мкл |
| 4 | 10% НП-40 | 1000 мкл |
Определение единицы измерения
Одна единица (Е) определяется как количество фермента, необходимое для удаления >95% углеводов из 10 мкг денатурированной РНКазы B за 1 час при 37°C в общем реакционном объеме 10 мкл.
Условия реакции
1. Растворите 1–20 мкг гликопротеина в деионизированной воде, добавьте 1 мкл 10-кратного гликопротеинового денатурирующего буфера и H2O (при необходимости), чтобы общий реакционный объем составил 10 мкл.
2.Инкубировать при 100°С 10 мин, охладить на льду.
3.Добавьте 2 мкл 10×GlycoBuffer 2, 2 мкл 10% NP-40 и перемешайте.
4.Добавьте 1–2 мкл PNGase F и H.2O (при необходимости) довести общий объем реакции до 20 мкл и перемешать.
5.Инкубируйте реакцию при 37°С в течение 60 мин.
6.Для анализа SDS-PAGE или анализа HPLC.
