мРНК Cap2'-O-метилтрансфераза

мРНК Cap 2´-O-метилтрансфераза была получена из рекомбинантного штамма E. coli, несущего ген мРНК Cap 2´-O-метилтрансферазы коровьей оспы.Этот фермент добавляет метильную группу в положение 2'-O первого нуклеотида, примыкающего к кэп-структуре на 5'-конце РНК. Фермент использует S-аденозилметионин (SAM) в качестве донора метила для метилирования кэпированной РНК (кэп -0), что приводит к структуре cap-1.

Структура Cap1 может повысить эффективность трансляции, улучшая экспрессию мРНК в экспериментах по трансфекции и микроинъекциям. Для этого фермента особенно требуется РНК с кэпом m7GpppN в качестве субстрата.Он не может использовать РНК с pN, ppN, pppN или GpppN на 5´-конце.Кэпированная РНК может быть получена посредством транскрипции in vitro с использованием кэп-аналога или посредством ферментативного кэпирования с использованием кэпирующего фермента коровьей оспы.

Компоненты

мРНК Cap 2´-O-метилтрансфераза (50 ед./мкл)

10 × буфер для кэппинг-реакций

Хранилище

-25 ～- 15 ℃ для хранения (Избегайте повторных циклов замораживания-оттаивания)

Буфер хранения

20 мМ Трис-HCl (рН 8,0, 25 ℃), 100 мМ NaCl, 1 мМ ДТТ, 0, 1 мМ ЭДТА, 0, 1 % Тритона Х-100, 50 % глицерина.

Определение единицы измерения

Одна единица определяется как количество фермента, необходимое для метилирования 10 пмолей 80-нуклеотидного транскрипта РНК за 1 час при 37°C.

Анализы контроля качества

Экзонуклеаза:50 ед. мРНК Cap 2´-O-метилтрансферазы с 1 мкг ДНК, переваренной λ-Hind III при 37 ℃ в течение 16 часов, не приводит к деградации, что определяется электрофорезом в агарозном геле.

Эндонуклеаза: 50 ед. мРНК Cap 2 ´ -O-метилтрансферазы с 1 мкг λДНК при 37 ℃ в течение 16 часов не приводят к разложению, что определяется электрофорезом в агарозном геле.

Никасе: 50 ед. мРНК Cap 2´-O-метилтрансферазы с 1 мкг pBR322 при 37 ℃ в течение 16 часов не приводят к разложению, что определяется электрофорезом в агарозном геле.

РНКаза: 50 ед. мРНК Cap 2´-O-метилтрансферазы с 1,6 мкг РНК MS2 в течение 4 часов при 37 ℃ не приводят к деградации, что определяется электрофорезом в агарозном геле.

E. палочка ДНК: 50 ед. мРНК Cap 2´-O-метилтрансферазы проверяют на наличиеE. палочка геномной ДНК с использованием TaqMan qPCR с праймерами, специфичными дляE. палочка Локус 16S рРНК.E. палочка загрязнение геномной ДНК = 1E. палочка геном.

Бактериальный эндотоксин: LAL-тест, согласно Китайской Фармакопее IV, издание 2020 г., метод определения предела содержания геля, общие правила (1143).Содержание бактериального эндотоксина должно составлять = 10 ЕЭ/мг.

Реакционная система и условия

1. Объедините необходимое количество закрытой РНК и H2O, не содержащего РНКазы, в микроцентрифужной пробирке объемом 1,5 мл до конечного объема 16,0 мкл.

2. Нагрейте при температуре 65 ℃ в течение 5 минут, а затем поместите в ледяную баню на 5 минут.

3. Добавьте следующие компоненты в указанном порядке (для метилирования кэпированной РНК

менее 10

*10× Буфер для реакции кэпирования: 500 мМ Трис-HCl (pH 8,0, 25 ℃), 50 мМ KCl, 10 мМ MgCl2 、 10 мМ DTT.

4. Инкубируйте при 37 ℃ в течение 1 часа (2 часа инкубации рекомендуются для целевого фрагмента размером менее 200 нт).

Приложения

Для улучшения экспрессии мРНК во время экспериментов по микроинъекциям и трансфекции.

Примечания по использованию

1. Перед проведением реакции РНК следует очистить и растворить в денуклеазной воде, все растворы не должны содержать ЭДТА и ионы.

2. Перед реакцией рекомендуется нагреть образец РНК при 65 ℃ в течение 5 минут, чтобы удалить вторичную структуру на 5-конце транскрипта.Для сложной 5´-концевой структуры оно может быть увеличено до 10 мин.