НАБОР ДЛЯ ИФА Двухцепочечная РНК (дцРНК)

Этот набор представляет собой комплекс иммуноферментного анализа (ИФА) с системой биотин-стрептавидин для количественного измерения дцРНК длиной более 60 пар оснований (п.н.), независимо от последовательности.Планшет был предварительно покрыт антителом против дцРНК.Присутствующая в образце дцРНК добавляется и связывается с антителами, нанесенными на лунки.Затем добавляют биотинилированное антитело против дцРНК, которое связывается с дцРНК в образце.После промывания добавляют HRP-стрептавидин, который связывается с биотинилированным антителом против дцРНК.После инкубации несвязавшийся HRP-стрептавидин смывают.Затем добавляют раствор субстрата ТМВ и катализируют с помощью HRP с получением продукта синего цвета, который меняется на желтый после добавления кислого стоп-раствора.Плотность желтого цвета пропорциональна целевому количеству дсРНК, захваченной в пластине.Поглощение измеряют при 450 нм.

Приложение

Этот набор предназначен для количественного измерения остаточной дцРНК.

Компоненты комплекта

Хранение и стабильность

1. Для неиспользованного комплекта: весь комплект можно хранить при температуре 2–8 ℃ в течение всего срока годности.Для обеспечения стабильности хранения следует избегать сильного света.

2. Для использованного набора: после открытия микропланшета закройте неиспользованные лунки герметиком для планшета и верните его в пакет из фольги, содержащий пакет с влагопоглотителем, запечатайте пакет из фольги и верните его в температуру 2–8 ℃ как можно скорее после использования.Другие реагенты следует вернуть к температуре 2–8 ℃ как можно скорее после использования.

Необходимые, но не поставляемые материалы

1. Считыватель микропланшетов с фильтром 450±10 нм (лучше, если он может обнаруживать волны на длинах волн 450 и 650 нм).

2. Шейкер для микропланшетов.

3. Наконечники и центрифужные пробирки без РНКазы.

Блок-схема операции

Прежде чем вы начнете

1. Перед использованием доведите все компоненты набора и образцы до комнатной температуры (18–25 ℃).Если набор не будет использован за один раз, извлеките полоски и реагенты только для данного эксперимента, а остальные полоски и реагенты оставьте в требуемом состоянии.

2. Промывочный буфер: разбавьте 40 мл 20-кратно концентрированного промывочного буфера 760 мл деионизированной или дистиллированной воды, чтобы получить 800 мл 1-кратного промывочного буфера.

3. Стандартный: перед использованием кратковременно центрифугируйте или центрифугируйте исходный раствор.Концентрация четырех предоставленных стандартов составляет 5 нг/мкл.Для стандартов дсРНК UTP и pUTP разбавьте исходный раствор до 1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312,0,0156,0 пг/мкл буфером STE, чтобы построить стандартную кривую.Для стандартов дсРНК N1-Me-pUTP разбавьте исходный раствор до 2,1,0,5,0,25,0,125,0,0625,0,0312, 0 пг/мкл буфером STE, чтобы нарисовать стандартную кривую.Для стандарта дсРНК 5-OMe-UTP разбавьте исходный раствор до 4,2,1,0,5, 0,25,0,125,0,0625, 0 пг/мкл буфером STE, чтобы нарисовать стандартную кривую.Мы рекомендуем разбавлять стандарты следующим образом:

4. Биотинилированные детектирующие антитела и рабочий раствор HRP-стрептавидина: перед использованием кратковременно центрифугируйте или центрифугируйте исходный раствор.Разбавьте их до рабочей концентрации буфером для разведения.

5. Подсостояние ТМБ: аспирируйте необходимую дозу раствора с помощью стерильных наконечников и не сливайте остатки раствора во флакон повторно.Подсостояние TMB чувствительно к свету, не подвергайте субстрат TMB воздействию света в течение длительного времени.

Использование протокола

1. Определите количество полосок, необходимое для анализа.Вставьте полоски в рамки для использования.Оставшиеся полоски планшета, не использованные в этом анализе, следует упаковать в пакет с влагопоглотителем.Плотно закройте пакет для хранения в холодильнике.

2. Добавьте по 100 мкл каждого разведения стандарта, холостого раствора и образцов в соответствующие лунки.Накройте герметиком для пластин.Инкубируйте в течение 1 часа при комнатной температуре при встряхивании со скоростью 500 об/мин.Для точного анализа образцы следует разбавить буфером STE до соответствующей концентрации.

3. Этап промывки: аспирируйте раствор и промывайте его 250 мкл промывочного буфера в каждую лунку и оставьте на 30 с.Полностью выбросьте промывной буфер, щелкнув пластину на впитывающую бумагу.Всего постирать 4 раза.

4. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл рабочего раствора биотинилированных детектирующих антител.Накройте герметиком для пластин.Инкубируйте в течение 1 часа при комнатной температуре при встряхивании со скоростью 500 об/мин.

5. Повторите этап стирки.

6. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл рабочего раствора HRP-стрептавидина.Накройте герметиком для пластин.Инкубируйте 30 мин при комнатной температуре при встряхивании со скоростью 500 об/мин.

7. Повторите этап стирки еще раз.

8. Добавьте в каждую лунку по 100 мкл раствора субстрата ТМБ.Накройте герметиком для пластин.Инкубируйте в течение 30 мин при комнатной температуре. Защищайте от света.Жидкость станет синей при добавлении раствора субстрата.

9. Добавьте в каждую лунку по 50 мкл стоп-раствора.Жидкость станет желтой при добавлении стоп-раствора.Затем запустите микропланшетный ридер и немедленно проведите измерение при длине волны 450 нм.

Подсчет результатов

1. Усредните повторяющиеся показания для каждого стандарта, контроля и образцов и вычтите среднюю оптическую плотность нулевого стандарта.Постройте стандартную кривую с поглощением на вертикальной оси (Y) и концентрацией дцРНК на горизонтальной оси (X).

2. Рекомендуется выполнять расчет с помощью компьютерного программного обеспечения для подбора кривой, такого как Curve Expert 1.3 или ELISA Calc, в нелинейной модели подбора с 5 или 4 параметрами.

Производительность

1. Чувствительность:

нижний предел обнаружения: ≤ 0,001 пг/мкл (для УТФ-, pUTP-, N1-Me-pUTP-дцРНК), ≤ 0,01 пг/мкл (для 5-OMe-UTP-дцРНК).

нижний предел количественного определения: 0,0156 пг/мкл (для УТФ-, pUTP-дсРНК), 0,0312 пг/мкл (для N1-Me-pUTP-дсРНК), 0,0625 пг/мкл (для 5-OMe-UTP-дсРНК).

2. Точность: КВ внутри анализа ≤10%, КВ между анализами ≤10%.

3. Восстановление: 80%~120%

4. Линейность: 0,0156-0,5 пг/мкл (для UTP-, pUTP-дцРНК), 0,0312-1 пг/мкл (для дцРНК N1-Me-pUTP), 0,0625-1 пг/мкл (для 5-OMe-UTP-дцРНК).

Соображения

1. Температура и время реакции ТМБ имеют решающее значение, пожалуйста, строго контролируйте их в соответствии с инструкцией.

2. Для достижения хорошей воспроизводимости и чувствительности анализа необходимо правильно промывать планшеты для удаления излишков непрореагировавших реагентов.

3. Все реагенты следует тщательно перемешать перед использованием и избегать путаницы во время добавления проб или реагентов.

4. Если в концентрированном промывочном буфере (20x) образовались кристаллы, нагрейте его до 37℃ и осторожно перемешайте до полного растворения кристаллов.

5. Избегайте анализа образцов, содержащих азид натрия (NaN3), так как он может разрушить активность HRP, что приведет к недооценке количества дцРНК.

6. Избегайте загрязнения РНКазой во время анализа.

7. Стандарт/образец, антитело для обнаружения и SA-HRP также можно использовать при комнатной температуре без встряхивания, но это может привести к снижению чувствительности обнаружения в один раз.В этом случае мы рекомендуем разбавлять стандарты дсРНК UTP и pUTP от 2 пг/мкл, стандарты дсРНК N1-Me-pUTP следует разбавлять от 4 пг/мкл, а стандарт дсРНК 5-OMe-UTP следует разводить от 8 пг/мкл.Кроме того, инкубируйте рабочий раствор HRP-стрептавидина в течение 60 минут при комнатной температуре.Не используйте шейкер для колб, поскольку шейкер для колб может привести к неточным результатам.

Типичный результат

1. Данные стандартной кривой

2. Расчет стандартной кривой

3. Диапазон обнаружения вкладыша: 0,0312-1 пг/мкл.